硝態(tài)氮處理對雪菊幼苗生長及代謝的影響

秦亞楠，楊增強，趙志信，鄧霜霜，褚佳瑤，李志慧，買爾丹·買買提，秦 勇

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)規(guī)劃研究院，烏魯木齊 830002)

0 引 言

【研究意義】雪菊，學名為兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)，又名昆侖雪菊、天山雪菊等，屬菊科金雞菊屬一年生草本植物[1]。雪菊是具有獨特功效的植物，我國野生雪菊主要生長于海拔3 000多m的昆侖山一帶，人工栽培主要在昆侖山北側(cè)的新疆和田地區(qū)。長期以來，雪菊被當?shù)鼐用癞敾ú栾嬘?，是一種具有廣闊前景和研究價值的藥用植物[2-3]。雪菊的主要代謝產(chǎn)物有多糖、蛋白質(zhì)、有機酸、黃酮類物質(zhì)等[4]，其藥理作用可能是多種代謝產(chǎn)物綜合作用的結(jié)果。氮素作為植物最重要的營養(yǎng)元素之一，對植物生長發(fā)育以及代謝起重要作用。研究表明,氮素可以影響植物類黃酮物質(zhì)的合成[5]，并以多種方式參與植物體內(nèi)各種代謝過程，對增進作物生長發(fā)育及品質(zhì)有著明顯作用[6]。【前人研究進展】Kovacik和Klejdus[7]對洋甘菊的研究發(fā)現(xiàn)，施用銨態(tài)氮可以顯著促進洋甘菊綠原酸的積累，增強酚酸物質(zhì)代謝。李志元等[8]研究表明，不施和少施銨態(tài)氮有利于雪菊的可溶性糖、總黃酮以及綠原酸的積累。張朋等[9-10]研究表明，增加施用硝態(tài)氮比例有利于提高杭白菊的根、莖、葉及花中總黃酮和綠原酸的含量。劉偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，全生育期缺氮比生殖期缺氮更有利于菊花根、葉及花中黃酮類化合物的積累?！颈狙芯壳腥朦c】氮對植物生長代謝的影響不僅與氮素形態(tài)、植物種類有關(guān)，在植物不同生育期的影響也不盡相同。目前，硝態(tài)氮對雪菊幼苗生長及代謝影響的研究未見報道。研究硝態(tài)氮對雪菊幼苗生長及代謝產(chǎn)物的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選出適宜雪菊幼苗生長的硝態(tài)氮肥施用量，為建立雪菊更加合理的施肥體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2019年3～5月在新疆農(nóng)業(yè)大學植物工廠工程技術(shù)研究中心的室內(nèi)外進行，測定項目在新疆農(nóng)業(yè)大學林學與園藝學院實驗室進行。

供試種子采自新疆和田地區(qū)皮山縣克里陽鄉(xiāng)，選取籽粒飽滿、大小一致的雪菊種子作為播種材料。

供試肥料為硝酸鈣、過磷酸鈣、硫酸鉀(天津市致遠化學試劑有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 盆栽試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置6個處理，每個處理15盆，重復3次，共計270盆。

當幼苗在穴盤中長至4～6片葉時，定植，定制盆為聚乙烯塑料盆(上下口徑分別為15 cm、13 cm，高為18 cm)，每盆定植1株幼苗。

供試土壤為明珠花卉市場購買的營養(yǎng)土，裝盆前使用多菌靈進行消毒，土壤農(nóng)化性狀委托新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心測定。表1

盆中氮、磷、鉀肥均作基肥一次性施入。另外每盆基施8g白云石來調(diào)節(jié)土壤pH值和補充鈣、鎂營養(yǎng)；同時每盆基施5mL 霍格蘭微量元素混合液以補充土壤微量營養(yǎng)元素[11]。表2

表1 供試土壤農(nóng)化性狀

Table 1 Basic physical and chemical properties of the soil used

項目Project有機質(zhì)Organicmatter(g/kg)全氮Totalnitrogen(g/kg)水解性氮Hydrolyzablenitrogen(mg/kg)速效磷Availablephosphorus(mg/kg)速效鉀Availablepotassium(mg/kg)pH含量Content218.48.18778.83253645.78

表2 硝態(tài)氮肥試驗設(shè)計

Table 2 Design of nitrate nitrogen fertilizer test

處理TrentmentN(g/kg)Ca(NO3)2·4H2O(g/basin)K(g/kg)K2SO4(g/basin)P(g/kg)Ca(H2PO4)2(g/basin)霍格蘭Hoagland(mL/basin)白云石Dolomite(g/basin)CK000.200.740.200.6658N10.101.680.200.740.200.6658N20.152.520.200.740.200.6658N30.203.360.200.740.200.6658N40.254.200.200.740.200.6658N50.305.040.200.740.200.6658

1.2.2 播種、育苗、移栽和緩苗

播種時間為2019年3月1日，采用72孔的育苗盤，育苗盤用多菌靈消毒后每穴播種3～5粒均勻、飽滿、無病蟲害的雪菊種子，輕輕覆蓋0.5 cm厚基質(zhì)。基質(zhì)配比為草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1，并用多菌靈消毒后使用。出苗1周后進行間苗，待幼苗長至4～6片葉時，選取大小一致，長勢較好的雪菊幼苗進行移栽。于3月25日進行裝盆移栽，移栽后在溫室里緩苗6 d，4月1日移至室外，此后室外栽培。

1.2.3 生長指標測定

2019年4月28日測定雪菊幼苗的各項生長指標，每個處理選取9株長勢均勻一致的雪菊苗進行測定。包括株高、莖粗、鮮重、根冠比、根長、幼苗分枝數(shù)(分支含3片以上進行統(tǒng)計)、葉片SPAD值(每個植株隨機選取位置相近的3片植株上部葉片，利用SPAD502葉綠素儀測定葉片葉綠素含量并計算其平均值)。

1.2.4 品質(zhì)測定

鮮樣處理：取雪菊幼苗相同部位的葉片(頂端向下3～5葉處)，于液氮中保存，待測。

干樣處理：取雪菊幼苗相同部位的葉片和根，分別用烘箱(105℃，30 min)殺青，60℃烘干；將烘干樣品粉碎研磨后用封口袋低溫保存，待測。

乙醇浸提：準確稱取0.500 g雪菊葉和根粉末于帶塞三角瓶中，加入70%乙醇25 mL，浸泡24 h后，超聲浸提30 min，然后過濾到50 mL容量瓶中，濾渣再超聲浸提一次，過濾到原容量瓶中，反復漂洗三角瓶及殘渣，最后定容到50 mL，然后放入冰箱，-20℃冷藏保存，待測[6]。

可溶性糖測定：稱取葉片處理干樣50 mg放入試管，加入15 mL蒸餾水，沸水浴20 min，過濾入100 mL容量瓶中，反復沖洗殘渣，定容至刻度。吸取提取液1 mL，加入5 mL蒽酮試劑，搖勻，沸水浴10 min取出冷卻，在620 nm波長處測定各溶液的吸光度，代入標準曲線，可求得可溶性糖含量[12]。

可溶性蛋白測定：稱取0.2 g葉片處理干樣，用5 mL蒸餾水研磨成勻漿后，以8 000 r/min離心10 min，取上清液定容至50 mL。吸取提取液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍試劑，搖勻，放置5 min在595 nm波長處測定各溶液的吸光度，代入標準曲線，可求得可溶性蛋白含量[12]。

總黃酮含量測定：吸取乙醇提取液1 mL，置于25 mL比容量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min后在512 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線，可求得黃酮的含量[13]。

綠原酸含量測定：將乙醇提取液稀釋5倍后吸取1 mL到10 mL試管中，加70%乙醇定容到l0 mL，搖勻，在328 nm波長處測定各溶液的吸光度，代入標準曲線，可求得綠原酸含量[14]。

1.2.5 PAL酶活性測定

PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性測定：參照Koukol和Corm的方法，采用索萊寶公司生產(chǎn)的PAL酶活性測定試劑盒進行PAL活性測定。稱取葉片鮮樣0.100 g，加入1 mL酶提取液，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，10 000 g，4℃離心10 min，取上清液，置于冰上待測。按照試劑盒說明加入反應試劑，30℃水浴30 min后，加入終止反應試劑，靜止10 min后，用對照管調(diào)零，在290 nm波長處記錄測定管吸光值，代入公式可求得PAL酶活性[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行整理和作圖，采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行方差分析及顯著性差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硝態(tài)氮處理對雪菊幼苗生長的影響

研究表明,施硝態(tài)氮對雪菊幼苗株高、莖粗、鮮重均有促進作用，與CK相比，株高、莖粗、鮮重均高于CK。N4、N5處理的株高、莖粗與CK存在極顯著差異；不同處理的鮮重與CK均存在極顯著差異，但N1、N2、N3處理之間無明顯差異。N4處理的株高達到最大值，為7.26 cm；N5處理的莖粗與鮮重最大，分別為0.40 cm、4.00 g。施硝態(tài)氮對雪菊幼苗的根冠比及根長具有一定的抑制作用，不同處理的根冠比與CK存在顯著差異，除N2處理外，其他處理達到了極顯著差異；除了N1處理，其他處理的根長與CK存在極顯著差異；N3處理的根冠比值最小，為0.38；N5處理的根長值最小，為12.14 cm。施硝態(tài)氮有利于雪菊幼苗地上部分的生長，而不施或少施硝態(tài)氮對根的生長具有一定的促進作用。表3

表3 不同硝態(tài)氮處理下雪菊幼苗生長變化Table 3 Effect of nitrate nitrogen treatment on the growth ofCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment株高Plantheight(cm)莖粗Stemdiameter(cm)鮮重Freshweight(g)根冠比Root-shootratio根長Rootlength(cm)CK6.01±0.10Bb0.28±0.01Bb1.54±0.05Dd0.52±0.06Aa13.82±0.25AaN16.11±0.05Bb0.30±0.03Bb2.20±0.12Cc0.40±0.02Bb13.70±0.21AaN26.02±0.10Bb0.31±0,02Bb2.12±0.19Cc0.44±0.03ABb12.45±0.14CcN36.04±0.11Bb0.31±0.02Bb2.02±0.15Cc0.38±0.04Bb13.09±0.20BbN47.26±0.16Aa0.37±0.02Aa3.17±0.31Bb0.41±0.03Bb12.51±0.13CcN57.18±0.23Aa0.40±0.02Aa4.00±0.18Aa0.40±0.05Bb12.41±0.20Cc

注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同

Note:Different lowercase letters after the same column data indicate significant difference (P<0.05),and different uppercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01),the same below

2.2 不同硝態(tài)氮處理對雪菊幼苗分枝數(shù)和SPAD值的影響

研究表明,施硝態(tài)氮對雪菊幼苗分枝數(shù)和SPAD值均有促進作用，幼苗分枝數(shù)和SPAD值與CK相比均高于CK。除N3處理外，其他處理的幼苗分枝數(shù)與CK存在顯著差異，N1、N4、N5處理與CK達到了極顯著差異；N5處理的SPAD值與CK存在極顯著差異。N5處理的幼苗分枝數(shù)和SPAD值達到了最大，分別為9.11和48.92。施硝態(tài)氮有利于促進雪菊幼苗分枝和提高葉綠素含量。表4

表4 不同硝態(tài)氮處理下雪菊幼苗分枝數(shù)和SPAD值變化

Table 4 Effect of nitrate nitrogen treatment on branching number and SPAD value ofCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment分枝數(shù)Numberofbranching葉綠素含量(SPAD值)Chlorophyllcontent(SPADvalue)CK7.56±0.20Cc44.67±0.74BbN18.33±0.33ABb46.67±1.55ABabN28.23±0.51ABCb46.82±1.30ABabN38.11±0.19BCbc45.11±1.23ABbN49.00±0.33ABa46.47±1.63ABabN59.11±0.38Aa48.92±1.73Aa

2.3 不同硝態(tài)氮處理對雪菊幼苗代謝產(chǎn)物的影響

2.3.1 可溶性糖

研究表明,與CK相比，各處理葉片中可溶性糖含量略高于CK，但各處理與CK相比無明顯差異。N4處理可溶性糖含量達到了最大，為32.63%，與CK相比增加17.33%。試驗表明施硝態(tài)氮對雪菊幼苗葉片中可溶性糖含量具有一定促進作用。表5

2.3.2 可溶性蛋白

研究表明,隨著硝態(tài)氮處理濃度的增加，雪菊幼苗葉片中可溶性蛋白含量均高于CK且基本呈現(xiàn)上升趨勢，各處理與CK相比達到了極顯著差異。N5處理可溶性蛋白含量達到了最大，為8.86 mg/g，與CK相比增加51.97%。施硝態(tài)氮對雪菊幼苗葉片中可溶性蛋白含量具有顯著促進作用。表5

表5 不同硝態(tài)氮處理下雪菊幼苗可溶性糖與可溶性蛋白變化

Table 5 Effect of nitrate nitrogen treatment on soluble sugar and soluble protein inCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment可溶性糖Solublesugarcontent(%)可溶性蛋白Solubleproteincontent(mg/g)CK27.81±0.76Aa5.83±0.19CcN131.22±0.87Aa7.81±0.39BbN230.50±3.69Aa8.31±0.42ABabN329.52±1.86Aa8.20±0.41ABabN432.63±2.08Aa8.73±0.27AaN530.14±3.03Aa8.86±0.43Aa

2.3.3 總黃酮含量

研究表明,與CK相比，各處理葉片和根中總黃酮均低于CK，且葉片中黃酮下降較為明顯。各處理葉片中黃酮含量與CK存在極顯著差異，除N1處理外，根中黃酮含量與CK存在顯著差異，N3、N4、N5處理達到了極顯著差異。N3處理葉片中黃酮含量最小，為69.75 mg/g，與CK相比下降23.10%。N5處理根中黃酮含量最小，為27.23 mg/g，與CK相比下降21.68%。施硝態(tài)氮對雪菊幼苗葉片及根中黃酮含量具有顯著抑制作用。表6

2.3.4 綠原酸含量

研究表明,與CK相比，各處理葉片中綠原酸含量均低于CK且基本呈現(xiàn)下降趨勢，除N1處理外，其他處理與CK存在極顯著差異。N5處理葉片中綠原酸含量最小，為8.55 mg/g，與CK相比下降21.20%。施硝態(tài)氮對雪菊幼苗葉片中綠原酸含量具有抑制作用，且施氮量越大抑制作用越明顯。表6

表6 不同硝態(tài)氮處理下雪菊幼苗總黃酮與綠原酸變化

Table 6 Effect of nitrate nitrogen treatment on total flavonoids and chlorogenic acid inCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment葉中總黃酮Totalflavonoidsinleaves(mg/g)根中總黃酮Totalflavonoidsinroot(mg/g)綠原酸Chlorogenicacid(mg/g)CK90.70±2.02Aa34.77±1.22Aa10.85±0.63AaN181.37±2.25Bb32.95±1.82ABab9.77±0.45ABabN279.28±2.31Bb31.56±1.35ABbc9.15±0.23BbcN369.75±3.72Cc29.69±1.89BCcd8.95±0.60BbcN479.15±3.11Bb29.55±0.67BCcd9.12±0.80BbcN578.03±3.98Bb27.23±0.85Cd8.55±0.77Bc

2.4 不同硝態(tài)氮處理對雪菊幼苗PAL活性的影響

植物的代謝分為初生代謝和次生代謝，其中植物的次生代謝有多條途徑，苯丙烷類代謝途徑是黃酮類化合物的合成代謝必經(jīng)的途徑。其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL) 是這一途徑中的3個關(guān)鍵酶，其活性直接影響到產(chǎn)物的合成數(shù)量[16]。苯丙氨酸解氨酶是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，也是苯丙烷類代謝途徑中研究最多的酶。圖1

圖1 硝態(tài)氮處理下雪菊幼苗葉片PAL活性變化

Fig.1 Effect of nitrate nitrogen treatment on PAL activity in leaves ofCoreopsistinctoriaseedlings

與CK相比，各處理葉片的PAL活性均低于CK，N4、N5處理葉片的PAL活性與CK存在顯著差異，但處理之間沒有明顯差異。N5處理葉片的PAL活性最低，與CK相比下降10.76%。施硝態(tài)氮對雪菊幼苗葉片PAL活性具有抑制作用，且施氮量多的抑制作用較為明顯。圖1

3 討 論

氮素作為植物最重要的營養(yǎng)元素之一，對植物的生長的影響較為直觀。研究結(jié)果表明，施硝態(tài)氮有利于促進雪菊幼苗地上部分生長，對地下部分生長具有一定的抑制作用。N5處理的株高、莖粗、鮮重、幼苗分枝數(shù)、葉綠素含量(SPAD值)等表現(xiàn)最佳，這與李志元、姜雅爽等研究結(jié)果基本一致[8,17]。Eriession和Vander研究發(fā)現(xiàn)，缺氮條件下，植物地上部生長受到抑制，植物加強碳水化合物的運輸?shù)礁?，促進根部的生長以獲得有限的限制性營養(yǎng)，從而增加根冠比[18-19]。林文等[20]研究發(fā)現(xiàn)，缺氮條件下還會誘發(fā)側(cè)根及新根的發(fā)育。研究結(jié)果表明，不施硝態(tài)氮有利于雪菊幼苗根冠比和根長的增加。

研究表明，隨著硝態(tài)處理濃度的增加雪菊幼苗葉片可溶性蛋白呈現(xiàn)上升趨勢，但對葉片中綠原酸、總黃酮以及根中總黃酮含量表現(xiàn)為抑制作用。這與劉大會等[21]在藥用菊花中的研究結(jié)果一致，不施硝態(tài)氮葉片中綠原酸、總黃酮以及根中總黃酮含量表現(xiàn)最佳[21]。施硝態(tài)氮對雪菊幼苗可溶性糖有一定促進作用，這與謝晉等[22]在烤煙中研究結(jié)果一致，試驗N4處理的可溶性糖表現(xiàn)最佳。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，其活性對黃酮、綠原酸等次生代謝的合成有重要影響。試驗研究表明，施硝態(tài)氮對PAL活性具有抑制作用，且處理濃度較高的抑制作用較為明顯，這與劉偉等在杭白菊中的研究結(jié)果一致[11]，試驗N5處理的PAL活性最低，與CK相比下降了10.76%。

氮素作為植物最重要的營養(yǎng)元素之一，對植物的生長及代謝有重要影響，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中合理施用氮肥是增產(chǎn)增收的重要手段。然而，植物在整個生育期對氮肥的需求并不相同，不同時期的合理施氮更有利于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。雪菊苗期施硝態(tài)氮肥，可以提高雪菊幼苗葉片中蛋白質(zhì)和葉綠素含量，增強其光合作用，促進可溶性糖含量的積累，為生長和代謝提供基礎(chǔ)。但施硝態(tài)氮肥對PAL活性具有抑制作用，導致PAL 活性降低，從而影響了黃酮、綠原酸的合成數(shù)量的下降。雪菊幼苗期中黃酮、綠原酸等影響品質(zhì)的代謝產(chǎn)物含量是否影響生殖期雪菊花的品質(zhì)還有待研究。

4 結(jié) 論

雪菊苗期施硝態(tài)氮肥，可以提高雪菊幼苗葉片中蛋白質(zhì)和葉綠素含量，從而增強其光合作用，促進可溶性糖含量的積累，為生長和代謝提供基礎(chǔ)。但施硝態(tài)氮肥對PAL活性具有抑制作用，導致PAL 活性降低，從而影響了黃酮、綠原酸合成的數(shù)量下降。

N5處理莖粗、鮮重、分枝數(shù)、SPAD、可溶性蛋白含量均為最大值，分別為0.40 cm、4.00 g、9.11 、48.92 、8.86 mg/g。N4處理株高和可溶性糖含量為最大值，分別為7.26 cm和32.63%。而根冠比、根長、葉中黃酮、根中黃酮、葉中綠原酸最大值均為CK，分別為0.52、13.82 cm、90.70 mg/g、34.77 mg/g、10.85 mg/g。CK處理中黃酮和綠原酸含量較高，但不施硝態(tài)氮肥嚴重限制了雪菊幼苗的生長和干物質(zhì)積累，CK處理中株高、莖粗、鮮重、分枝數(shù)、SPAD、可溶性糖、可溶性蛋白均為最小值，分別為6.01 cm、0.28 cm、1.54 g、7.56、44.67、27.81%、5.83 mg/g。雪菊幼苗期黃酮、綠原酸等影響品質(zhì)的代謝產(chǎn)物含量是否影響生殖期雪菊花的品質(zhì)還有待研究，幼苗期生物量的積累是雪菊后期生長發(fā)育以及產(chǎn)量形成的保證。硝態(tài)氮施用量以N4、N5為宜即0.25 ～0.3 g/kg營養(yǎng)土。