正交試驗(yàn)優(yōu)化八味茵術(shù)顆粒劑提取工藝及其顆粒劑的制備研究

戈大春 王卓君* 韋翠萍

（1 蘇州市吳中人民醫(yī)院 江蘇 蘇州 215128）

（2 蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇 蘇州 215128）

濕疹是一種過敏性炎癥性皮膚病，為皮膚科常見多發(fā)病，易成慢性，病程遷延，容易反復(fù)發(fā)作。李東垣在《脾胃論·脾胃盛衰論》中說：“百病皆由脾胃衰而生也。”有些慢性、難治性皮膚病的病因病機(jī)都與脾胃功能失調(diào)有著相當(dāng)密切的關(guān)系。脾失健運(yùn)，則濕從內(nèi)生，浸淫皮膚，如濕瘡、濕疹、奶癬、老年性皮膚瘙癢癥等。其治療也要以健中補(bǔ)脾，促進(jìn)運(yùn)化為基本方。八味茵術(shù)顆粒為我院的自擬協(xié)定處方，由茵陳、生白術(shù)等八味中藥組成，經(jīng)過多年臨床使用，療效確切，主要的功效是健脾利濕，方中白術(shù)健脾益氣[1-2]，茵陳利濕退黃[3-4]，共為君藥，在皮膚科得到廣泛應(yīng)用。臨床用于皮膚科濕瘡、濕疹，對于脾失健運(yùn)的胃腸道癥狀，如胃納差、惡心腹脹、大便溏泄等也具有很好的效果。為了方便臨床應(yīng)用，對方中有效成分提取工藝進(jìn)行多指標(biāo)優(yōu)化，經(jīng)減壓干燥得到干膏為原料，干法制粒的方法來制備顆粒劑。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMAZU LC-2030C 3D高效液相色譜儀(日本SHIMAZU公司)；Sartorius BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；fzg-16板式真空干燥箱（杭州三特醫(yī)藥化工設(shè)備有限公司）；Buchi小型噴霧干燥儀（Germany）；GX-10B多功能粉碎機(jī)（浙江高鑫工貿(mào)有限公司）；GL-25干法制粒機(jī)（江蘇張家港市開創(chuàng)機(jī)械制造有限公司）；AC220-240V超聲波清洗機(jī)（深圳深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材與標(biāo)準(zhǔn)品

藥材：生白術(shù)購自于江蘇福源中藥飲片有限公司，茵陳、蒼術(shù)等其余七味藥材購自天馬（安徽）國藥科技股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品：6,7-二甲氧基香豆素（批號：111740-200702，中國藥品生物制品檢定所）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號：111978-201501，中國藥品生物制品檢定所）

1.3 試劑

乙腈（HPLC，MERCK，Germany）；甲醇（HPLC，MERCK，USA）；硬脂酸鎂（批號：20170329，CP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）

2.方法與結(jié)果

2.1 6,7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的HPLC測定

色譜條件：inertSustain? C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm，Japan），柱溫30℃，DAD檢測（200nm～400nm），流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為5 μL，流動(dòng)相為水（A）-乙腈（B）梯度洗脫，0～10.0min，55% MPB，10.0～25.0min，55%～95%MPB，25.0～25.1min，95%～55%MPB，25.1～30.0min，55%MPB。

對照品溶液的制備：取6,7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含1.0mg的溶液。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，0.45μm濾膜濾過，即得。

供試品溶液的制備：精密量取八味茵術(shù)顆粒20.0g，置20 mL具塞錐形瓶中，加入25mL甲醇：水（1∶1），室溫超聲提取15min，過濾，取續(xù)濾液5mL，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，0.45μm濾膜濾過，即得含量測定的樣品溶液。

2.2 提取工藝的研究

對提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)，參考方中君藥白術(shù)、茵陳提取工藝的文獻(xiàn)，提取效率的影響因素主要包括：加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間，確定加水量和優(yōu)化工藝，分析是否有顯著性差異。取出的樣品液經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂屘幚?，HPLC進(jìn)行指標(biāo)性成分含量檢測。

2.2.1 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 提取效率的影響因素主要包括：加水量（A）、提取次數(shù)（B）、提取時(shí)間（C），正交試驗(yàn)采用四因素、三水平的正交表進(jìn)行試驗(yàn)，其因素水平表見表1，正交試驗(yàn)表選用L9(34)，未能安排的空白列作為誤差。

表1 因素、水平表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以指標(biāo)性成分6,7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量為優(yōu)先考慮指標(biāo)，綜合干膏得率，采用方差分析F檢驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，選取最佳的提取工藝。見表2～5。

表2 八味茵術(shù)顆粒提取正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 八味茵術(shù)顆粒提取正交試驗(yàn)方差分析表（6,7-二甲氧基香豆素含量）

表4 八味茵術(shù)顆粒提取正交試驗(yàn)方差分析表（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量）

表5 八味茵術(shù)顆粒提取正交試驗(yàn)方差分析表（出膏率）

經(jīng)方差分析，因素A、B有顯著差異，其中對于茵陳的指標(biāo)性成分，因素A有顯著性差異，對于白術(shù)的指標(biāo)性成分，因素B有顯著性差異，對于干膏得率來說，各因素都沒有顯著差異，八味茵術(shù)顆粒這一協(xié)定方為復(fù)方制劑，不能單純以其中某一味藥物的含量來確定提取工藝，綜合含量和干膏得率的分析，相對于因素A、B，因素C無顯著性差異，結(jié)合臨床實(shí)際工作，在本實(shí)驗(yàn)的條件下八味茵術(shù)顆粒提取工藝組合為A3B2C1的提取液有效成分煎出率相對高，故最終確定提取工藝為加水量10倍、8倍，提取2次，提取時(shí)間0.5 h、0.5 h。

2.2.3 提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

取三份合格飲片，每帖100 g，按優(yōu)化后的煎煮方法進(jìn)行提?。ㄋ幉募逯笄敖?0min，加入10倍量水煎煮30min，藥渣加入8倍量水煎煮30min，將兩次的湯液合并濃縮），比較分析提取液指標(biāo)性成分、干膏得率（總提取物量），確定提取工藝。試驗(yàn)見表6，所得指標(biāo)性成分的含量與正交試驗(yàn)表中的結(jié)果相比有明顯提高，且平行性良好，工藝較為穩(wěn)定。

表6 續(xù)斷優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3 濃縮工藝研究

取八味茵術(shù)顆粒大提提取液（30公斤藥材提?。┻m量于60℃、70℃、80℃的水浴中，以提取液在指標(biāo)性成分6,7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量為指標(biāo)，分別考察提取液在0h、2h、4h、6h、8h的穩(wěn)定性。不同時(shí)間取出的樣品液經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂屘幚?，HPLC進(jìn)行檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明續(xù)斷提取液在60℃、70℃、80℃條件下8h內(nèi)均穩(wěn)定，可在80℃條件下進(jìn)行濃縮，見表7。

表7 八味茵術(shù)顆粒提取液在不同溫度、不同時(shí)間下成分的含量（μg·mL-1）

2.4 干燥工藝研究

取八味茵術(shù)顆粒大提提取液（30公斤藥材提?。┎⑦m當(dāng)濃縮，選擇真空干燥、噴霧干燥法，進(jìn)行比較，以提取液干燥前后在指標(biāo)性成分的含量、所得到的干粉性狀和干粉得率為指標(biāo)，篩選合適的干燥方法。從干燥過程和干粉的形狀角度，兩種干燥方法都可以，干燥過程相對容易，兩種干燥方法所得到的藥粉不黏壁，流動(dòng)性也好，吸濕性相對強(qiáng)，真空干燥、噴霧干燥的浸膏粉收率分別為85.01%、88.15%。但是從指標(biāo)性成分6,7-二甲氧基香豆素和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的角度，真空干燥（4.61、34.74μg/g）稍優(yōu)于噴霧干燥（3.68、29.14μg/g）。故綜合考慮表明真空干燥的方法比較適合于八味茵術(shù)顆粒提取液。

2.5 制粒工藝研究

2.5.1 處方的選擇 選擇八味茵術(shù)顆粒真空干燥浸膏粉作為原料藥，通過加入不同輔料和調(diào)整輔料的用量，以顆粒成型情況和制粒過程順利與否為指標(biāo)，篩選出最優(yōu)處方。

處方為：99.0%八味茵術(shù)顆粒減壓干燥粉，1.0%硬脂酸鎂。以上處方出片光潔，顆粒色澤均一，硬度適中，不粘輪，成品率高，可選擇此處方為制粒處方。

將所得到的顆粒和輔料硬脂酸鎂取相同的質(zhì)量，用甲醇：水（1∶1）溶解成相同的濃度，HPLC測定，液相條件參照2.1項(xiàng)下。結(jié)果證明制粒的過程對于含量基本沒有影響，制粒的過程和加入的輔料對于指標(biāo)性成分含量也沒有影響。HPLC色譜圖見圖1、2。

圖1 制粒后與硬脂酸鎂比較的HPLC色譜圖a.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ

圖2 制粒后與硬脂酸鎂比較的HPLC色譜圖b.6,7-二甲氧基香豆素

2.5.2 工藝的考察 對處方進(jìn)行工藝篩選，以顆粒質(zhì)量、顆粒得率為考察指標(biāo)，對壓輪壓力（MPa）、壓輪轉(zhuǎn)速（r/min）、送料速度（r/min）三個(gè)因素進(jìn)行單因素水平考察，每個(gè)因素進(jìn)行三個(gè)不同水平的考察，最終確定處方的最優(yōu)工藝條件。

2.5.2.1 壓輪壓力的考察 固定壓輪轉(zhuǎn)速和送料速度，以顆粒質(zhì)量、成品率為考察指標(biāo)，當(dāng)壓輪轉(zhuǎn)速為5r/min，送料速度為15r/min時(shí)，分別對比壓輪壓力為15MPa、20MPa、25MPa時(shí)對制粒工藝的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)壓輪壓力為20MPa時(shí)，出片連續(xù)；顆粒硬度適中、無色差，細(xì)粉少，成型性好；得率為82%。

2.5.2.1 壓輪轉(zhuǎn)速的考察 固定送料速度，以顆粒質(zhì)量、成品率為考察指標(biāo)，選擇壓輪壓力為20MPa，當(dāng)送料速度為15r/min時(shí)，分別對比壓輪轉(zhuǎn)速為4.0r/min、4.8r/min、5.5r/min時(shí)對制粒工藝的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)壓輪轉(zhuǎn)速為4.8r/min時(shí)，出片連續(xù)；顆粒硬度適中、無色差，成品得率較高，細(xì)粉少，得率為80%。

2.5.2.3 送料速度的考察 以顆粒質(zhì)量、成品率為考察指標(biāo)，選擇20MPa的壓輪壓力和4.8r/min的壓輪轉(zhuǎn)速，分別對比送料速度為10r/min、12r/min、15r/min時(shí)對制粒工藝的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)送料速度為15r/min時(shí)，出片連續(xù)；顆粒硬度適中、無色差，成品得率較高，細(xì)粉少，得率為83%。

根據(jù)單因素考察結(jié)果選擇干法制粒機(jī)技術(shù)參數(shù)為壓輪壓力20MPa、壓輪轉(zhuǎn)速4.8r/min、送料速度為15r/min。綜合處方及工藝的考察，確定了八味茵術(shù)顆粒的干法制粒處方和條件：干燥浸膏粉99.0%；硬脂酸鎂1.0%；壓輪壓力20MPa、壓輪轉(zhuǎn)速4.8r/min、送料速度為15r/min。

3.討論

八味茵術(shù)顆粒為一中藥復(fù)方制劑，具有健脾利濕之功效，中藥復(fù)方成分復(fù)雜，干擾因素多，不能單純以單一指標(biāo)性成分來確定提取的效率，方中白術(shù)、茵陳為君藥，白術(shù)有明確的健脾益氣、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的功能的特點(diǎn)[5-9]，最近還有研究表明白術(shù)的主要活性成分白術(shù)內(nèi)酯I、II、Ⅲ體內(nèi)外有抗輪狀病毒（RV）的作用[10]。茵陳利濕退黃，同樣具有多種的藥理作用[11-13]，這兩味也是方中用藥劑量比較大的藥味，故選用6,7-二甲氧基香豆素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為指標(biāo)性成分，結(jié)合干膏得率綜合考察，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)表明優(yōu)化的提取工藝可行性和穩(wěn)定性都較好。

制粒方法選用干法制粒，以干浸膏為原料，處方為99.0%減壓干燥粉，1.0%硬脂酸鎂。干法制粒所得到的成品顆粒硬度適中、無色差，細(xì)粉少，成型性好。處方中選擇了潤滑劑硬脂酸鎂，硬脂酸鎂的加入可以增加浸膏粉的流動(dòng)性和潤滑性，對比加入硬脂酸鎂和不加入硬脂酸鎂進(jìn)行干法制粒，無論從顆粒的硬度、色澤、可壓性以及最后剩余細(xì)粉這些方面，加入硬脂酸鎂都比不加入效果好。另外在制粒方法方面，對比了干法制粒和濕法制粒，濕法制粒采用傳統(tǒng)擠出制粒，3倍的糊精作為稀釋劑，顆粒硬度適中、無色差、成型性良好，但與干法制粒相比，載藥量少，病人服用量增加，吸濕性也比干法制粒的強(qiáng)，從工業(yè)化中式放大以及可行性的角度，干法制粒更加符合現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)自動(dòng)化的要求，且質(zhì)量可控性強(qiáng)，故最后選用干法制粒來制備八味茵術(shù)顆粒。所得到顆粒劑外觀好，細(xì)粉少，為其后期的相關(guān)制劑研究以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。