超聲造影時間-強度曲線與乳腺癌血管生成擬態(tài)生成及區(qū)域分布的相關(guān)性分析

樊 靜 ，蔣曉春 ，史點順 ，洪建軍 ，湯曉晴 ，王 蓓

（1浙江省義烏復(fù)元私立醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科 浙江 義烏 322000）

（2浙江省中醫(yī)院乳腺中心 浙江 杭州 310000）

血管生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展得重要機制之一，其中血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是不依賴于內(nèi)皮細胞的新腫瘤供血模式，是腫瘤細胞模仿機體血管內(nèi)皮細胞血管生成并通過自身基因型反轉(zhuǎn)變形和細胞外基質(zhì)重塑形成瘤細胞條索樣微循環(huán)管道，為腫瘤細胞提供血液供應(yīng)[1]。學(xué)者們常通過免疫組化及特殊染色的方式進行標(biāo)記，新生血管管壁由CD31或CD34等內(nèi)皮細胞標(biāo)記物染色陽性的血管內(nèi)皮細胞和PAS染色陽性的基底膜構(gòu)成，而VM結(jié)構(gòu)是由CD31或CD34等內(nèi)皮細胞標(biāo)記物染色陰性的腫瘤細胞和PAS染色陽性的基底膜構(gòu)成[2]。目前在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中等多種組織中均發(fā)現(xiàn)VM的存在，且其存在與患者預(yù)后密切相關(guān)[4]。目前關(guān)于超聲造影（Contrast enhanced ultrasound，CEUS）與VM 陽性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌相關(guān)性的研究比較少[4]，本研究擬通過進行CEUS時間-強度曲線（time intensity curve， TIC）觀察VM陽性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)特征，從而探討CEUS與腫瘤VM生成及區(qū)域分布的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取浙江省義烏復(fù)元私立醫(yī)院和浙江省中醫(yī)院2016年1月—2018年12月經(jīng)手術(shù)病理證實為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者167例（167個病灶），均為女性，年齡（28～72）歲，平均（56.2±10.3）歲。所有患者手術(shù)前均行常規(guī)超聲及CEUS檢查，檢查前未行穿刺活檢及任何臨床治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：①腫塊樣病灶；②病灶＜4cm；③均獲得手術(shù)病理。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非腫塊樣病灶；②病灶≥4cm；③失訪患者。所有患者CEUS檢查前簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)超聲檢查 采用esaote MyLabClassC彩色多普勒超聲診斷儀，LA532變頻線陣探頭頻率為10～13MHz。患者取仰臥位，充分暴露雙側(cè)乳腺，在常規(guī)超聲下觀察病灶位置、大小、數(shù)目、回聲及血流特征，并根據(jù)血流分布選擇病灶的最佳切面，選定圖片切面盡量包括病灶及其周圍正常乳腺組織。

1.2.2 CEUS檢查 采用esaote MyLabClassC彩色多普勒超聲診斷儀系統(tǒng)自帶軟件超聲造影匹配成像技術(shù)（contrast-tuned imaging，CnTI）。固定探頭位置不變切換到CEUS模式，造影參數(shù)設(shè)置恒定。造影劑采用Bracco公司超聲造影劑SonoVue（Bracco，Italy）。使用前注入生理鹽水5ml，振蕩搖勻，配制成微泡懸濁液（濃度5mg/ml）。經(jīng)肘靜脈團注5ml后計時，隨即團注入5ml生理鹽水，記錄造影全過程并存盤。整個造影全過程約3分鐘。

1.2.3 CEUS圖像區(qū)域界定 由兩位有5年經(jīng)驗超聲醫(yī)生在未知患者臨床資料情況下復(fù)習(xí)所存貯圖像，并將病灶的不同區(qū)域劃分為：①中央?yún)^(qū)：病灶中央部位直徑約1cm的區(qū)域，若病灶較小可適當(dāng)縮小取樣框。②邊緣區(qū)：以超聲造影后病灶增強范圍的邊界為外界的區(qū)域，取樣盡量避開腫瘤滋養(yǎng)血管。③病灶旁乳腺正常組織：正常乳腺腺體組織。所有區(qū)域ROI面積相近，取樣框盡量處于同一屏幕及深度，見圖1。用美蘭標(biāo)記腫塊的研究切面，在邊緣帶的取樣區(qū)域留下美蘭，并且在研究切面的皮膚層劃線。

圖1：VM陰性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者（a）CEUS（b）TIC。VM陽性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者（c）CEUS和（d）TIC。

1.2.4 CEUS圖像分析 利用QontraXt軟件行定量分析。描記ROI后，生成灌注參數(shù)立體三維圖像及灌注曲線。每個ROI記錄參數(shù)包括：始增時間（initial time，IT）、峰值強度（peak intensity，PI）、達峰時間（peak time，PT）、上升斜率（rising slope，RS）[（峰值強度-始增強度）/（峰值時間-始增時間）]、消除斜率（descending slope，DS）[（峰值強度-始增強度）/（平均渡越時間-峰值時間）]、平均渡越時間（mean transit time，MTT）、曲線下面積（area under curve，AUC）。

表1 單純DCIS組與浸潤性癌組患者臨床病理特征比較

表2 VM陽性組造影參數(shù)（±s）

表2 VM陽性組造影參數(shù)（±s）

53 0.60±0.25 50.67±23.63 0.02±0.01 1.82±1.13 48.56±12.48 2642.55±136.63中心區(qū) 18.02±6.93 0.56±0.28 53.79±24.52 0.02±0.01 1.73±1.02 47.83±12.57 2503.53±128.84病灶旁乳腺組織 20.64±5.72 0.48±0.21 58.83±27.34 0.01±0.01 1.51±0.97 43.67±11.74 2378.52±128.63 VM陽性組 IT（s） PI（dB） PT（s） RS（dB/s） DS（dB/s） MTT（s） AUC（dB/s）邊緣區(qū) 15.47±8.t 11.429 4.235 12.483 3.572 6.245 3.583 23.534 P 0.024 0.368 0.001 0.249 0.074 0.534 0.000

1.2.5 乳腺癌術(shù)后病理分析 所有乳腺癌標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，行分別HE染色和CD34/PAS雙染色，CD34/PAS雙染色步驟[5]如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，修復(fù)時選擇檸檬酸微波修復(fù)方式，隨后行CD34著色，再利用DAB顯色，利用導(dǎo)致相差顯微鏡觀察（×100）。觀察中一旦發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)著色情況，立即用流水清洗，時間至少在1min上，終止整個反應(yīng)；第二步將切片浸于濃度0.5%的過碘酸溶液中，并氧化反應(yīng)10～15min，接著利用流水沖洗2min；置于Schiff液中，避光環(huán)境下反應(yīng)15～20min，再流水沖洗2min；偏重亞硫酸鈉反應(yīng)2次，1min/次；流水沖洗2次，2min/次；蘇木素淺染細胞核，脫水、透明、中性樹膠封片。VM的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①含有血細胞的管腔。②管腔壁細胞由CD31染色結(jié)果陰性的腫瘤細胞構(gòu)成。③PAS染色結(jié)果陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；二分類變量和無序變量采用χ2或Fisher's確切概率法進行比較。多組間比較采用ANOVA方差進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

所有患者超聲測量腫瘤平均大?。?.74±1.03）cm。浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ級70（41.92%）例，Ⅱ級57（34.13%）例，Ⅲ級40例（23.95%）。淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移者82（49.10%）例，轉(zhuǎn)移者85（50.90%）例。VM陽性組患者病理分級以Ⅱ、Ⅲ級為主，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更為常見，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而VM陽性和陰性組患者腫瘤大小無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

2.2 VM陽性和VM陰性組患者CEUS比較

CEUS TIC結(jié)果顯示VM陽性組患者PI明顯增高、PT顯著縮短、AUC明顯增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。兩組患者在IT、RS、DS和MTT上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 VM陽性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組織比較

VM陽性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組 織 IT分 別 為（15.47±8.53）s、（18.02±6.93）s、（20.64±5.72）s；PT分 別 為（50.67±23.63）s、（53.79±24.52）s、（58.83±27.34）s；AUC分 別 為（2642.55±136.63）dB/s、（2503.53±128.84）dB/s、（2378.52±128.63）dB/s，三組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中PI、RS、DS和MTT無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

2.4 VM陰性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組織比較

VM陰性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組織 PI分 別 為（0.61±0.27）dB、（0.45±0.18）dB、（0.41±0.20）dB。AUC分別為（2642.55±136.63）dB/s、（2411.46±145.76）dB/s、（2236.67±146.88）dB/s，二組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中IT、PT、RS、DS和MTT無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表3。

表3 VM陰性組造影參數(shù)（±s）

表3 VM陰性組造影參數(shù)（±s）

72 0.61±0.27 58.59±22.68 0.01±0.01 1.55±1.46 45.34±11.52 2642.55±128.65中心區(qū) 21.24±4.62 0.45±0.18 54.25±20.53 0.01±0.01 1.48±0.89 44.42±11.07 2411.46±145.76病灶旁乳腺組織 20.78±5.45 0.41±0.20 52.67±20.83 0.01±0.01 1.35±0.92 43.26±10.85 2236.67±146.88 VM陰性組 IT（s） PI（dB） PT（s） RS（dB/s） DS（dB/s） MTT（s） AUC（dB/s）邊緣區(qū) 20.67±6.t 1.035 17.235 5.768 1.214 5.458 2.558 13.548 P 0.958 0.002 0.076 0.985 0.245 0.782 0.001

3 討論

VM屬于腫瘤組織內(nèi)的功能性微循環(huán)的一種，其發(fā)現(xiàn)源于Maniots等[6]研究葡萄膜黑色素瘤時發(fā)現(xiàn)直徑＞1cm的瘤體中央未見血管內(nèi)皮依賴的血管，以及未見壞死區(qū)域，但可見大量PAS染色陽性。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)將活性炭注入惡性黑色素瘤小鼠模型時可見活性炭顆粒分布于VM結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮依賴性血管中央[7]，證實VM是腫瘤組織內(nèi)的功能性微循環(huán)，該發(fā)現(xiàn)為VM的影像學(xué)檢查提供了組織學(xué)依據(jù)。

影像學(xué)是活體狀態(tài)下量化評估VM是否存在及其密度的重要方法，其可作為瘤體內(nèi)微循環(huán)的評價指標(biāo)之一，為術(shù)前分級、預(yù)測靶向治療療效及預(yù)后提供重要依據(jù)。目前研究報道采用DCE-MRI評估乳腺癌模型VM生成實驗發(fā)現(xiàn)VM陽性組腫瘤由周邊至中央呈均勻性逐漸增強，而VM陰性組腫瘤表現(xiàn)為中央無明顯強化，該結(jié)果經(jīng)病理、電鏡及免疫組化證實VM陽性組瘤體中央無血管內(nèi)皮樣結(jié)構(gòu)及明顯壞死及纖維化，并可見VM血管通路[8]。而經(jīng)過抗血管生成治療后的腫瘤，DCE-MRI可發(fā)現(xiàn)VM陽性腫瘤治療后其外周和中心區(qū)域的VEGF表達、VM表達與Ktrans值間均具有正相關(guān)關(guān)系[9]。研究還采用CEUS對裸鼠卵巢癌移植瘤模型研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤VM密度、微血管密度與PI、MTT呈正相關(guān)[10]。故以上研究表明DCE-MRI、CEUS可檢測腫瘤VM血管的存在及其密度。然而，其用于患者臨床評估VM的存在及其數(shù)量尚未見報道。

本研究利用CEUS定量參數(shù)評估CEUS與VM生成及其分布的相關(guān)性，結(jié)果表明VM陽性組患者PI增加，PT延長，AUC增加，與以往卵巢癌研究一致[10]，認為VM陽性腫瘤具有更高更快的造影劑充盈特性，分析原因可能為VM管道內(nèi)部很少具有微血栓形成，其通過表達血管內(nèi)皮鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等改變腫瘤細胞之間的粘附方式，影響腫瘤細胞微環(huán)境，調(diào)節(jié)凝血功能等機制有關(guān)[11]。此外，VM管道形成還受到腫瘤細胞的牽張力、細胞外基質(zhì)生成等因素影響，使得VM管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有更好的血液循環(huán)功

能[12]。

此外，本研究將VM陽性及陰性病灶分別從邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺正常組織進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VM陽性腫瘤邊緣區(qū)IT和PT縮短，AUC增加，三者顯著高于腫瘤中央?yún)^(qū)和乳腺正常組織，而VM陰性腫瘤則出現(xiàn)邊緣區(qū)PI和AUC增加現(xiàn)象，該研究結(jié)果與MRI及病理研究結(jié)果一致[8,13,14]，認為VM更多存在于病灶邊緣區(qū)，并且附近無壞死或周圍炎性細胞，故其整體瘤體增強為均勻性高增強，其PI在中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū)無顯著差異。反之VM陰性組瘤體周邊PI高于中央?yún)^(qū)，其中央?yún)^(qū)出現(xiàn)出血壞死，從而導(dǎo)致造影劑呈充盈缺損征象。其原因可能為腫瘤細胞排列在VM通道的內(nèi)表面上，這些細胞可通過分泌蛋白酶降解相鄰的結(jié)締組織并滲入血管的基底膜，直接暴露于血流從而使造影劑更易于進入腫瘤內(nèi)部，并使腫瘤更容易發(fā)生血液轉(zhuǎn)移到其他區(qū)域[4]。該現(xiàn)象反之也證明了VM陽性腫瘤具有高度惡性、可塑性和低分化的特性，而本研究結(jié)果認為乳腺癌 VM陽性腫瘤患者病理分級更高，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象更為常見也揭示了VM與乳腺癌的高侵襲性、不良預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，VM陽性乳腺癌惡性程度更高，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更為常見。VM陽性乳腺癌PI明顯增高、PT顯著縮短、AUC明顯增大。其中VM陽性乳腺癌邊緣區(qū)CEUS TIC顯示IT和PT較中央?yún)^(qū)顯著縮短，AUC明顯增大，而VM陰性乳腺癌邊緣區(qū)PI和AUC較中央?yún)^(qū)增高。CEUS可作為VM生成和分布的有效評估方法。