蛋白酶水解底物特異性機(jī)制研究進(jìn)展

熊科，鄧?yán)?，柳佳蕓，裴鵬鋼

1(北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京，100048)2(北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，100048)3(北京工商大學(xué) 北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)4(北京工商大學(xué) 北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

蛋白酶在食品、醫(yī)藥、資源環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛[1-2]。不同蛋白酶由于酶切作用方式及酶切位點(diǎn)不同，對底物的水解效率存在差異。酶切位點(diǎn)的專一性對酶解產(chǎn)物的成分與組成和比例均有較大影響，可直接影響最終產(chǎn)物的應(yīng)用價(jià)值[3]。比如，蛋白酶特異性水解所得到的一些小分子肽類(如谷胱甘肽[4]、活性蛋白[5-7]等)，對某些疾病(如心血管疾病[8-11]、乳糜瀉[12]、腫瘤[13]、癌癥[14]等)具有特殊治療功效。此外，在小麥麥芽糖化過程中添加蛋白酶特異性水解免疫原性谷蛋白肽可以降低谷蛋白含量，具有生產(chǎn)無麩質(zhì)啤酒的潛力[15]。而目前采用的酶法分解蛋白質(zhì)的過程中酶解特異性通常較差，功能性的特異成分產(chǎn)率低，提純成本高，這限制了蛋白酶解方式的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。因此，在已有的蛋白酶酶解機(jī)制的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究蛋白酶如何特異性酶解底物，有利于蛋白酶深度應(yīng)用于改善食品加工工藝[16-17]、高效生產(chǎn)特殊功效因子和減輕環(huán)境污染[18-19]等領(lǐng)域中。而目前蛋白酶特異性水解底物的分子機(jī)制研究，多集中于對蛋白酶底物與蛋白酶結(jié)合催化規(guī)律的研究。隨著分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，對蛋白酶水解特異性研究也不斷深入，蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)、具有催化功能和結(jié)合功能的一些氨基酸殘基在蛋白酶的底物選擇性和水解特異性方面起重要的決定作用。本文圍繞蛋白酶的水解特異性，綜述了與酶特異性相關(guān)的底物基團(tuán)性質(zhì)、酶與底物結(jié)合部位氨基酸側(cè)鏈以及酶分子表面電荷等方面的研究進(jìn)展，以期為今后蛋白酶的特異性酶解體系研究與應(yīng)用提供參考。

1 蛋白酶催化底物的基本機(jī)制

蛋白酶按照蛋白酶水解多肽的方式不同，可以分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類。內(nèi)肽酶是從蛋白質(zhì)內(nèi)部將肽鏈切斷，形成相對分子質(zhì)量較小的肽段、朊和胨，工業(yè)上應(yīng)用的蛋白酶主要是內(nèi)肽酶；外肽酶是從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基末端逐一切斷肽鍵，形成游離氨基酸[20]。雖然蛋白酶的基本催化機(jī)制可描述為蛋白酶催化蛋白質(zhì)分子中肽鏈(即酰胺鍵)斷裂，生成肽鏈長度較短的肽分子或游離氨基酸，但是普通的蛋白酶催化反應(yīng)并不能準(zhǔn)確反映蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解的實(shí)際過程。

蛋白酶催化底物的基本機(jī)制可以總結(jié)為以下主要學(xué)說。誘導(dǎo)契合學(xué)說認(rèn)為，酶與底物可通過電性吸引、疏水相互作用而相互靠近并進(jìn)行定向。酸堿催化理論認(rèn)為，酶催化底物時(shí)是通過酶瞬時(shí)地向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物接受質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)的進(jìn)行。共價(jià)催化又稱為親和催化或者電子催化，在催化的時(shí)候，親核催化劑或者親電子催化劑分別放出電子或者汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負(fù)電子，迅速形成不穩(wěn)定的共價(jià)中間復(fù)合物，降低反應(yīng)的活化能，加速反應(yīng)[21]。

在催化反應(yīng)中一般是幾種基元催化反應(yīng)共同作用。在胰凝乳蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)中，酶活性中心的Ser195、His57、Asp102構(gòu)成一個(gè)氫鍵體系，使得His57的咪唑基成為Asp102羧基及Ser195羥基間的橋梁，Ser195受His57及Asp102的影響成為較強(qiáng)的親核基團(tuán)，提供電子；在這一反應(yīng)過程中His57的咪唑基起著廣義酸堿化作用，它先促進(jìn)Ser195的羥基親核地附著在底物敏感肽鍵的羥基碳原子上，形成共價(jià)的酰化中間物，再促進(jìn)?；拿?底物中間物上的?；D(zhuǎn)移到水或其他的?；荏w(如氨基酸)上。這樣，胰凝乳蛋白酶通過Asp102、His57、Ser195組成的“電荷中繼網(wǎng)”催化底物蛋白肽鍵水解，包括親核催化和堿催化等催化反應(yīng)如圖1所示。

圖1 胰凝乳蛋白酶的催化三聯(lián)體Fig.1 Catalytic triad of chymotrypsin

與胰凝乳蛋白酶相似的是，絲氨酸堿性蛋白酶的活性位點(diǎn)也有一個(gè)親核的絲氨酸殘基，需要天冬氨酸和組氨酸殘基與活性位點(diǎn)的絲氨酸相連組成催化三聯(lián)體，由催化底物水解。該過程涉及靜電效應(yīng)、共價(jià)催化和酸堿催化等共同作用。但是，與胰凝乳蛋白酶的特異性作用于芳香族氨基酸不同，它具有廣泛的底物專一性，可以作用于大多的疏水性氨基酸。因此，僅考慮催化基本機(jī)制，無法解釋蛋白酶底物特異性之間的差異。

2 蛋白酶水解底物的特異性作用機(jī)制

酶的催化能力局限于酶分子的一定區(qū)域，只有少數(shù)特異性的氨基酸殘基參與底物的結(jié)合與催化，而這種區(qū)域中與酶活直接相關(guān)的部位稱為酶的活性中心?；钚灾行目煞譃榇呋课缓徒Y(jié)合部位，前者負(fù)責(zé)催化底物鍵的斷裂，形成新鍵，決定著酶的催化能力；后者負(fù)責(zé)與底物結(jié)合，決定酶的特異性，即決定蛋白酶的底物特異性之間的差異。

如圖2所示的胰蛋白酶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)中，Ser195、His57、Asp102為胰蛋白酶的催化殘基，Gly26、Asp189、Ser190為關(guān)鍵氨基酸，與遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)元件(由殘基169-175、184-195和213-228組成)決定了該酶的底物特異性。蛋白酶酶切作用方式和對酶切位點(diǎn)的專一性影響底物的水解效率以及酶解產(chǎn)物組成，而具有不同特異性和作用機(jī)制的蛋白酶的組合使用還可以改善蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的功能和生物學(xué)特性[22]。因此，蛋白酶特異性的選擇對酶解效率和酶解產(chǎn)物具有重要意義。目前蛋白酶的水解底物特異性研究主要集中在以下幾方面。

圖2 胰蛋白酶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)Fig.2 The key structure of trypsin

2.1 底物蛋白氨基酸肽鍵的側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)

從蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物中分離出來的常見氨基酸只有20種，除了脯氨酸及其衍生物以外，這些氨基酸結(jié)構(gòu)上的共同點(diǎn)是與相鄰的α-碳原子上都有1個(gè)氨基、1個(gè)氫原子和1個(gè)可變的側(cè)鏈(稱為R基)，不同氨基酸的區(qū)別就在于R基的不同。蛋白酶水解蛋白質(zhì)肽鍵的反應(yīng)如圖3所示。

圖3 蛋白酶催化肽鍵水解Fig.3 Protease catalyzes the hydrolysis of peptide bonds

研究表明，內(nèi)肽酶從蛋白質(zhì)內(nèi)部將肽鏈切斷，其對R1和/或R2基團(tuán)具有特異性要求(表1)，且其水解側(cè)鏈的氨基酸必須是L-型[23]。

表1 常見蛋白酶的種類和底物特異性Table 1 Types of common proteases and substrate specificity

就常用的蛋白酶而言，如α-胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶B和α-裂解蛋白酶水解，胰蛋白酶、凝血酶，彈性蛋白酶，木瓜蛋白酶，無花果蛋白酶，菠蘿蛋白酶等水解特異性研究已較為成熟，其對R1基團(tuán)具有較高的特異性要求。據(jù)報(bào)道，谷氨酰內(nèi)肽酶(GE)對牛β-酪蛋白的水解具有高度特異性，其主要水解β-酪蛋白中R1側(cè)鏈為谷氨酸(Glu)殘基的肽鍵，同時(shí)還水解R1側(cè)鏈為天冬氨酸(Asp)殘基的肽鍵，但后者的水解程度較??；在研究曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶(An-PEP)對β-酪蛋白水解特異性時(shí)也發(fā)現(xiàn)，An-PEP主要水解β-酪蛋白中R1側(cè)鏈為脯氨酸(Pro)殘基的肽鍵，也有一定水解R1側(cè)鏈為丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)等殘基的肽鍵的能力；天冬氨酸蛋白酶類型的胃蛋白酶則主要水解R1側(cè)鏈為天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)以及芳香族氨基酸殘基的肽鍵；在對稻田鰻魚中胃蛋白酶特異性研究中發(fā)現(xiàn)，盡管該酶會優(yōu)先切割某些大體積的疏水性氨基酸殘基，但對其他殘基的切割較為隨機(jī)，對R1側(cè)鏈為亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)殘基的肽鍵具有高水解率[24-26]。因此，可以推測出絕大部分絲氨酸蛋白酶(彈性蛋白酶除外)、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶對R1基團(tuán)都具有較為明顯的特異性要求。

而有些蛋白酶，如嗜熱菌蛋白酶對R2基團(tuán)具有較高的特異性要求。在GE對牛α-酪蛋白進(jìn)行水解研究中，蛋白底物氨基酸序列為Glu-Glu-X(X=Arg、Asn、Ile和Ser)和Glu-Glu-Glu-Lys時(shí)該酶優(yōu)先水解Glu-X和Glu-Lys，因此推測谷氨酰內(nèi)肽酶(GE)可能對R2側(cè)鏈為賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Asn)、異亮氨酸(Ile)和絲氨酸(Ser)等殘基的肽鍵具有較強(qiáng)的水解特性。另外，胃蛋白酶對R2基團(tuán)也有特異性要求，如果R2側(cè)鏈為苯丙氨酸(Phe)殘基，那么這種酶能以最高的速率水解肽鍵。由此可以推測，絕大部分絲氨酸蛋白酶對R2基團(tuán)幾乎沒有特異性要求(谷氨酰內(nèi)肽酶除外)，半胱氨酸蛋白酶對R2基團(tuán)沒有特異性要求，而天冬氨酸蛋白酶對R2基團(tuán)有較強(qiáng)的特異性要求。

在底物蛋白氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)的研究過程中，大多采用LC-MS、RP-HPLC和QTOF-MS/MS、HPLC-ESI MS和MS/MS等液相色譜和質(zhì)譜手段來進(jìn)行蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的分析，通過水解產(chǎn)物的種類和數(shù)量來確定特異性的切割位點(diǎn)，從而深入認(rèn)識其水解底物的特異性。盡管如此，目前對蛋白酶的水解底物氨基酸肽鍵的側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)，并未形成一個(gè)較為統(tǒng)一、全面的機(jī)制性認(rèn)識。就絲氨酸蛋白酶而言，它包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶等，其活性部位中除了含有絲氨酸殘基外，一般還有咪唑基。盡管絲氨酸蛋白酶的作用模式基本相同，但是其與底物相結(jié)合的特異性基團(tuán)不盡相同。由此可見，關(guān)于底物氨基酸肽鍵的側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)的研究還有待細(xì)化和深入，需形成一個(gè)較為全面和統(tǒng)一的特異性規(guī)律，為進(jìn)一步提高蛋白酶針對性地水解蛋白提供理論支撐。

2.2 酶與底物的結(jié)合部位

蛋白酶的位點(diǎn)專一性，即能識別底物蛋白質(zhì)中專一的氨基酸順序，其識別機(jī)制與核酸限制性內(nèi)切酶類似，由酶與底物的特異性結(jié)合決定。多肽底物的結(jié)合部位，橫交于酶表面，即酶的底物結(jié)合亞部位，用Sn表示；底物上的氨基酸殘基，即與酶結(jié)合的部位，用Pn(對肽類來說)表示；基本模式如圖4所示。

圖4 蛋白酶與底物結(jié)合部位Fig.4 The site where the protease binds to the substrate

結(jié)合部位的特異性結(jié)構(gòu)決定了底物多肽的氨基酸順序的特異性識別[28]。

楊凌燕等[29]在利用噬菌體肽庫進(jìn)行底物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)(如圖5-a所示)：當(dāng)P1處為色氨酸(W)時(shí)P2處為側(cè)鏈較小的氨基酸(丙氨酸(A))或堿性氨基酸(組氨酸(H)、精氨酸(R)),P3處也多為側(cè)鏈較小的氨基酸(丙氨酸(A)、絲氨酸(S))或堿性氨基酸(甲硫氨酸(M))；而當(dāng)P1處為酪氨酸(Y)時(shí)，P2、P3處多為側(cè)鏈較大的氨基酸(苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、亮氨酸(L))。

通過最適宜切割位點(diǎn)的確定，得到的W-R間形成的肽鍵能很好地與胰凝乳蛋白酶的底物結(jié)合部位結(jié)合。由此可見，芳香族氨基酸與堿性氨基酸的組合易被胰凝乳蛋白酶作用，而精氨酸(R)無論處在任何位置對水解往往都有促進(jìn)作用。LOPES等[30]研究昆蟲胰蛋白酶的底物特異性(圖5-b)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在P1處會優(yōu)先水解精氨酸(R)以及賴氨酸(K)；而昆蟲胰蛋白酶亞位點(diǎn)的結(jié)合偏好是：P3和P1′處多為丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)等疏水殘基，P2和P2’處多為苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)等疏水殘基。SCHULZ等[31]在治療麥膠性腸病和減少蛋白質(zhì)水解液苦味的研究中，在擔(dān)子菌金針菇的培養(yǎng)上清液中鑒定出脯氨酰內(nèi)肽酶FvpP，并在米曲霉中功能性地表達(dá)基因驗(yàn)證，通過比較分析得出FvpP具有與來自黑曲霉(An-Pep)的脯氨酰內(nèi)肽酶幾乎相同的P1-P1’底物特異性，如圖5-c所示，能水解大多數(shù)-Pro-X-鍵(X=苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、絲氨酸(S)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y))，說明兩者都能夠降解富含脯氨酸的大蛋白質(zhì)。

a-胰凝乳蛋白酶;b-胰蛋白酶;c-脯氨酰內(nèi)肽酶圖5 三種蛋白酶的主要特異性位點(diǎn)Fig.5 The main specific sites of three proteases

另一方面，底物與酶的結(jié)合部位的氨基酸側(cè)鏈的大小和結(jié)構(gòu)，也對蛋白酶的底物特異性有著重要影響。α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶與相結(jié)合底物的部位均成口袋狀，如圖6所示，但三者具有不同的底物特異性。α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶口袋狀結(jié)合部位的開口處均為Gly-216和Gly-226，體積較大的氨基酸殘基的側(cè)鏈能順利進(jìn)入口袋。

圖6 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶與彈性蛋白酶Fig.6 Chymotrypsin, trypsin and elastase

彈性蛋白酶口袋狀結(jié)合部位的開口處被Val-216和Thr-226兩個(gè)大的氨基酸殘基側(cè)鏈所占據(jù)，因此，只有小體積的氨基酸殘基如-CH3才能進(jìn)入，這樣彈性蛋白的R1-只能為丙氨酸殘基。而賴氨酰內(nèi)肽酶的底物結(jié)合位點(diǎn)，由D225與鄰近的T189、S214共同形成緊密的S1專一性口袋，狹窄的S1口袋只能容納線性側(cè)鏈的氨基酸，其中只有精氨酸和賴氨酸等具有足夠長的側(cè)鏈才能達(dá)到S1口袋底部，但由于D225從側(cè)面進(jìn)入S1口袋并且與精氨酸的側(cè)鏈胍基在空間上不相容，從而阻礙了S1口袋與精氨酸的結(jié)合[32]。因此，S1專一性口袋的體積限制和D225對精氨酸的阻礙確保了賴氨酰內(nèi)肽酶的賴氨酸特異性。角蛋白酶口袋中位于中間位置的Tyr215疏水性增加使得該酶酶活力先增后減，而側(cè)鏈空間大小的增加或口袋的縮小使得對P1位氨基酸殘基較小的底物酶活增加[33]。

一些蛋白酶優(yōu)先水解肽鍵的這種專一性特點(diǎn)，在一些反應(yīng)系統(tǒng)中還達(dá)不到要求，因?yàn)橛械膶Φ孜锴懈钗稽c(diǎn)附近的氨基酸順序要求比較嚴(yán)格，因此加深對酶的底物結(jié)合亞部位以及底物與酶的結(jié)合部位的氨基酸側(cè)鏈的大小和結(jié)構(gòu)的研究，是提高底物專一性的重要途徑。對結(jié)合部位的研究，可以更加準(zhǔn)確切割目標(biāo)位點(diǎn)，從而有效地提高蛋白酶的針對性。目前，利用蛋白酶與底物的結(jié)合特點(diǎn)，進(jìn)行蛋白酶篩選底物的方法也十分豐富，今后也會呈現(xiàn)一種更加多樣化的趨勢。如，基于固載的混合蛋白質(zhì)為篩選庫進(jìn)行蛋白酶底物篩選，將混合蛋白質(zhì)通過化學(xué)作用鍵合到固相載體上作為篩選庫，此時(shí)蛋白庫與蛋白酶孵育，其中被蛋白酶酶切的底物蛋白產(chǎn)生的肽段進(jìn)入溶液，未被酶切的非底物蛋白則留在固相載體上，固液分離后質(zhì)譜定性定量鑒定溶液中底物肽段后即可得到特異性底物蛋白信息[34]。

2.3 酶分子表面電荷作用

酶分子表面電荷的改變，在不破壞相對活性和穩(wěn)定性的情況下可使其活性部位周圍的靜電場發(fā)生改變，從而改變活性部位催化基團(tuán)解離常數(shù)pKa，而活性催化基團(tuán)的解離則直接影響到酶作用的pH范圍，使得酶在不同的微環(huán)境下有著不同的底物偏好性[35]。α-胰凝乳蛋白酶含有的Ser-189/Asp-189羧基的負(fù)電荷可以與底物如賴氨酸ε-氨基的正電荷形成靜電相互作用，從而與底物特異性結(jié)合。在胰蛋白酶酶解?；竺椎鞍椎难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，酰化作用使蛋白質(zhì)表面的凈負(fù)電荷增加，有利于胰蛋白酶S1結(jié)合袋中Asp殘基的負(fù)電荷與底物肽鏈中P1端的負(fù)電荷匹配，從而益于胰蛋白酶與蛋白的結(jié)合[36]。由此推測，底物表面電荷的變化會影響酶分子表面電荷的作用，從而影響酶與底物的特異性結(jié)合。中溫胰蛋白酶與嗜冷胰蛋白酶的特異性差異，在于特異性口袋外的非保守帶電殘基以及在S1口袋產(chǎn)生的電場在性質(zhì)和幅度上的不同，前者表面電荷通常產(chǎn)生正向誘導(dǎo)S1口袋，而后者表面電荷產(chǎn)生該區(qū)域的負(fù)電場[37]。張爽[38]研究乳酸菌蛋白酶對凝乳品質(zhì)的影響，證實(shí)了金屬離子對乳酸菌蛋白酶特異性水解對應(yīng)的酪蛋白的活力有較大的影響，其中Fe2+影響最大，結(jié)果表明金屬離子可能與酶的結(jié)合部位有關(guān)。

由此可以推測，表面電荷的變化，會提高蛋白酶的特異性或者引起底物的偏好性變化，甚至可能直接改變作用底物的范圍，使得酶分子具有異于野生型的特異性。因此，通過調(diào)整蛋白酶與底物作用的微環(huán)境，如酶分子表面電荷作用，可以達(dá)到蛋白酶特異性改造的目的。盡管酶分子表面電荷作用的研究不多，卻也是蛋白酶特異性設(shè)計(jì)改造的重要方式之一。

3 展望

蛋白酶底物特異性對酶解產(chǎn)物的成分與組成都有較大影響，可直接影響最終產(chǎn)物的應(yīng)用價(jià)值。因此，充分利用蛋白酶的特異性提高酶解效率和獲取特異目標(biāo)產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥、環(huán)境和飼料等領(lǐng)域有著廣泛前景[39-42]。目前大多利用化學(xué)修飾、理性設(shè)計(jì)、非理性設(shè)計(jì)以及其他基因工程技術(shù)對蛋白酶進(jìn)行改造，提高蛋白酶穩(wěn)定性、產(chǎn)物產(chǎn)量以及底物特異性等，使得蛋白酶的應(yīng)用更加具有針對性[43]；但就化學(xué)修飾方法而言，雖然可以定向改進(jìn)酶的底物特異性，但由于在實(shí)際操作過程中化學(xué)反應(yīng)的參與在一定程度上會影響酶的空間構(gòu)象，從而可能會導(dǎo)致酶活有一定程度的損失，不利于酶的進(jìn)一步利用[44]；通過分子設(shè)計(jì)來改變蛋白酶的特異性，也會伴隨一些問題，如：以損失酶活為代價(jià)來提高其底物的專一性或極端環(huán)境耐受性[45-47]。因此，為提高酶解效率、得到特異目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)解決酶解法生產(chǎn)特異性產(chǎn)物的局限性問題，達(dá)到簡化工序、減少資源浪費(fèi)與環(huán)境污染以及降低成本等目的，研究者們?nèi)孕枰獜牡鞍酌附Y(jié)合部位的基團(tuán)、電荷等方面對水解特異性機(jī)制進(jìn)行深入地研究，通過對酶解體系進(jìn)行改造修飾、利用基因工程等手段來提高蛋白酶的水解特異性，以期擴(kuò)大蛋白酶在食品、醫(yī)藥、環(huán)境資源利用與開發(fā)以及化工生產(chǎn)等方面的應(yīng)用。