Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)、BD BECTEC960及改良抗酸染色法在肺結(jié)核灌洗液中的應(yīng)用價值

李丹 陳麗茹 劉玉潔

(衡水市第三人民醫(yī)院檢驗科，河北 衡水 053000)

肺結(jié)核的確診主要為痰抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，但均存在明顯的局限。隨著纖維支氣管鏡的發(fā)展及普及，通過對氣管肺泡灌洗液進(jìn)行相關(guān)檢測，肺結(jié)核的診斷率逐步提高[1]。本研究分析新型分子檢測方法利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增(Xpert MTB/RIF)檢測系統(tǒng)、BD BECTEC960及改良抗酸染色法在肺結(jié)核灌洗液中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年4月我院收治的疑診肺結(jié)核患者80例，其中男54例，女26例，年齡18～60歲，平均(43.29±8.77)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有疑似肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、咳嗽、咯血、胸悶等)；(2)纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗前3次痰涂片抗酸染色陰性或無痰；(3)胸部影像學(xué)改變(肺部陰影、感染或結(jié)節(jié))考慮活動性肺結(jié)核可能；(4)有纖支氣管鏡術(shù)及灌洗術(shù)適應(yīng)證，取得氣管肺泡灌洗液，接受Xpert MTB/RIF檢測、BD BECTEC960及改良抗酸染色法檢測；(5)臨床各項資料完善；(6)患者及家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肺外結(jié)核、復(fù)治肺結(jié)核；合并嚴(yán)重的其他感染性疾?。?2)伴發(fā)認(rèn)知功能、交流障礙；(3)既往曾接受抗結(jié)核治療；(4)具有精神病、癲癇病史；(5)依從性差；(6)妊娠。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過。

1.2診斷方法 疑診肺結(jié)核患者以細(xì)菌學(xué)檢查陽性為確診結(jié)核病的依據(jù)，無細(xì)菌學(xué)陽性結(jié)果者則按《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2]進(jìn)行診斷。

1.3檢測方法 患者均進(jìn)行纖維支氣管鏡(奧林巴斯BF-P30)檢查，觀察各肺段支氣管黏膜病變情況，結(jié)合胸部影像學(xué)檢查結(jié)果明確病變累及肺段的支氣管，并進(jìn)行刷檢、涂片，然后實施灌洗，相應(yīng)支氣管肺段以纖支鏡灌入10～20 mL生理鹽水，并用纖維支氣管鏡負(fù)壓吸引回收灌洗液至無菌瓶內(nèi)，可重復(fù)灌洗2～3次，最終確保收集灌洗液約10 mL，送醫(yī)院實驗室后平均分裝于①、②、③三管中，分別進(jìn)行改良抗酸染色法、BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF技術(shù)法檢測。(1)改良抗酸染色法：將肺泡灌洗液標(biāo)本以3000轉(zhuǎn)/min離心(離心半徑15 cm)20 min，詳細(xì)步驟參照中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會制定的實驗室檢查規(guī)程[3]進(jìn)行操作，抗酸桿菌涂片染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。(2)BD BECTEC960法：以BD BECTEC960全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)先后完成分枝桿菌的快速培養(yǎng)與藥敏鑒定，全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)及配套試劑購自美國BD公司。(3)Xpert MTB/RIF檢測：將1 mL肺泡灌洗液中加入1mL樣本處理液充分混勻，放置15 min并間斷搖晃至樣本完全液化，并以無菌吸管將2 mL液體移入試劑盒中，后者插入Gene Xpert檢測平臺中，輸入樣本相關(guān)信息后運(yùn)行，Gene Xpert儀器自動完成樣本的過濾、洗滌，超聲溶菌釋放出DNA后與PCR反應(yīng)試劑混合，以半巢式實時擴(kuò)增并檢測熒光信號，儀器可于2 h后自動給出檢測結(jié)果，Gene Xpert儀器及試劑盒購自美國Cepheid公司。

1.4結(jié)果判讀 (1)改良抗酸染色法根據(jù)抗酸染色量的多少判定4+、3+、2+、1+和陰性。(2)BD BECTEC960法：結(jié)合BD BECTEC960系統(tǒng)報陽情況以涂片萋尼染色鏡檢排除雜菌的污染后進(jìn)行液體藥物敏感性試驗，并統(tǒng)計儀器報陽時間。(3)Xpert MTB/RIF系統(tǒng)的結(jié)果以循環(huán)次數(shù)(CT)確定結(jié)核分枝桿菌檢出情況，分為高(CT<16)、中(CT 16～22)、低(CT 23～28)、極低(CT 29～38)和未檢出(CT>38)5個量級；并明確利福平ropB基因的不同耐藥位點。

2 結(jié) 果

2.1三種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的效能評價 58例患者明確診斷為肺結(jié)核，22例為非肺結(jié)核，包括慢性阻塞性肺疾病7例、普通肺炎6例、支氣管擴(kuò)張4例、肺癌4例及播散性非結(jié)核分枝桿菌肺病1例。以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，氣管肺泡灌洗液行BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均高于改良抗酸染色法，BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌的效能接近。見表1。

表1 三種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的效能評價(n，%)

2.2Xpert MTB/RIF檢測半定量結(jié)果與改良抗酸染色法、BD BECTEC960法檢測結(jié)果的關(guān)系 Xpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果分為高、中、低、極低和未檢出5個量級，15例高量級患者中，改良抗酸染色法檢測陽性率為100%，染色陽性級別3+～4+者占93.33%，隨著量級降低，陽性率、染色陽性級別3+～4+者所占百分比逐漸下降(χ2=13.95，18.32，P<0.05)；15例高量級患者中，液體培養(yǎng)法檢測陽性率為100%，報陽時間時間(17.22±2.56)d，隨著量級降低，陽性率逐漸下降(χ2=14.93，P<0.05)，報陽時間逐漸升高(F=19.07，P<0.05)。表2。

表2 Xpert MTB/RIF檢測半定量結(jié)果與改良抗酸染色法、BD BECTEC960法檢測結(jié)果的關(guān)系

2.3耐藥分析結(jié)果 同時獲取Xpert MTB/RIF檢測、BD BECTEC960法檢測結(jié)果均為陽性的52例患者藥物敏感性試驗結(jié)果，顯示二者對利福平的耐藥率分別為19.23%、21.15%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.06，P>0.05)；以液體藥物敏感性試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測菌株對利福平耐藥的敏感性、特異性分別為81.82%、97.56%。見表3。

表3 兩種檢測方法檢測菌株對利福平耐藥情況對比(n)

3 討 論

Xpert MTB/RIF技術(shù)是集樣品準(zhǔn)備、標(biāo)本處理、DNA提取、定量PCR擴(kuò)增和熒光擴(kuò)增檢測于一身的核酸擴(kuò)增檢測分析系統(tǒng)，目前主要用于結(jié)核分枝桿菌特異核酸以及利福平耐藥基因rpoB突變檢測，在獨立的反應(yīng)孔中加入待檢測樣品后2h內(nèi)即可快速獲取檢測標(biāo)本中是否含有結(jié)核菌及是否對利福平耐藥[4-5]。本研究結(jié)果顯示，肺泡灌洗液行BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌的效能接近，且檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均高于改良抗酸染色法，表明 Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)、BD BECTEC960及改良抗酸染色法均可用于氣管肺泡灌洗液檢測以提高肺結(jié)核的診斷效能，與相關(guān)研究[6-8]結(jié)果一致。

本研究Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果分為高、中、低、極低和未檢出5個量級，15例高量級患者中，改良抗酸染色法檢測陽性率為100%，染色陽性級別3+～4+占93.33%，隨著量級降低，陽性率、染色陽性級別3+～4+所占百分比逐漸下降；15例高量級患者中，液體培養(yǎng)法檢測陽性率為100%，報陽時間時間(17.22±2.56) d，隨著量級降低，陽性率逐漸下降，報陽時間逐漸升高。提示Xpert MTB/RIF系統(tǒng)半定量量級程度可能與患者結(jié)核分枝桿菌菌數(shù)正相關(guān)，與陽性患者結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時間負(fù)相關(guān)，這與N.Kwak[9]等的觀點類似，但本研究中的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步證實，但仍可以認(rèn)為Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果與BD BECTEC960及改良抗酸染色法檢測結(jié)果密切相關(guān)。此外，Xpert MTB/RIF檢測、BD BECTEC960法檢測細(xì)菌對利福平的耐藥率分別為19.23%、21.15%，差異不明顯，提示二者具有較好的一致性；且以液體藥物敏感性試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測菌株對利福平耐藥的敏感性、特異性均高于80%，進(jìn)一步證實Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)可快速判定是否對利福平耐藥。與國內(nèi)報道[10]一致。因此，Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)、BD BECTEC960及改良抗酸染色法中建議優(yōu)先選擇對肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF檢測。