中華獼猴桃根中TUA體外抗炎作用研究*

邱吉漢，程齊來(lái)，郭小華，金 奇，鄭精國(guó)

(1.贛州市立醫(yī)院 贛南醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院 藥劑科；2.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

炎癥反應(yīng)是臨床常見(jiàn)的病理過(guò)程，是指動(dòng)物機(jī)體針對(duì)促炎因子、致炎因素、外界對(duì)機(jī)體的刺激發(fā)生的以防御反應(yīng)為主的應(yīng)答反應(yīng)，以局部組織的變質(zhì)、滲出和增生變化為主要表現(xiàn)[1]。無(wú)論中醫(yī)臨床還是西醫(yī)臨床上均有“十病九炎”的說(shuō)法，主要的原因是很多疾病的病變基礎(chǔ)就是炎癥。目前西醫(yī)臨床治療炎癥的藥物主要為腎上腺皮質(zhì)激素類和非甾體類抗炎藥等。雖然這兩種藥物在臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)揮了一些積極作用，但同時(shí)也表現(xiàn)出不良反應(yīng)較多等弊端。中醫(yī)臨床中所涉及的瘡瘍、癰腫、疔毒等病證與西醫(yī)臨床所述的炎癥病理過(guò)程相似，一般應(yīng)用有清熱解毒、活血化淤等功效的中藥進(jìn)行防治[2]。已有研究結(jié)果表明，一些中草藥特別是從中提取分離得到的一些化學(xué)單體(天然產(chǎn)物)具有良好的抗炎效果，同時(shí)具備不良反應(yīng)較少的優(yōu)點(diǎn)[3]。中華獼猴桃根A.chinensisRadix，又名藤梨根，是我國(guó)江西贛南地區(qū)應(yīng)用較為廣泛的清熱解毒中草藥，在民間一直有其可冶“無(wú)名腫毒”之說(shuō)。中華獼猴桃根中含有多種藥理活性成分，前期研究表明烏蘇烷型三萜類粗提物表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗炎作用。TUA (2β, 3β, 23-trihydroxy-urs-12-en-28 -oic acid)是從贛南地區(qū)資源分布較豐富的中華獼猴桃根ActinidiachinensisRadix中提取、分離并鑒定得到的一個(gè)烏蘇烷型五環(huán)三萜類主要活性成份之一。目前未見(jiàn)有TUA抗炎作用相關(guān)報(bào)道。本研究利用脂多糖(1ipopoly- saccharide，LPS)誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞建立炎癥模型，通過(guò)測(cè)定TUA對(duì)細(xì)胞因子的影響，觀察體外抗炎效果，并初步闡明其抗炎作用機(jī)理，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑TUA 由本課題組前期從中華獼猴桃ActinidiachinensisRadix (Actinidiaceae) 根中提取分離得到。使用溶劑提取法與多種柱層析法對(duì)該藥材根部進(jìn)行分離，利用現(xiàn)代理化分析和波譜檢測(cè)技術(shù)(UV，MS，IR，NMR等)對(duì)所得到的一系列化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終得到了烏蘇烷型三萜化合物TUA，采用Agilent1100 HPLC，DAD檢測(cè)器，面積歸一法測(cè)定其純度，結(jié)果含量>96.7%。在本次實(shí)驗(yàn)中， TUA 用二甲亞砜(DMSO)溶解。溶劑DMSO的最終濃度≤0.1%；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的藥品一般貯存在-4 ℃冰箱中≤4天。

LPS(批號(hào)173M5115V)、MTT，Sigma公司產(chǎn)品；DMEM(高糖)、DMSO，Bio-Rad公司；胎牛血清(FBS)，ThermoFisher Scientific公司產(chǎn)品。Griess法NO檢測(cè)試劑盒，Bio-Rad公司產(chǎn)品； IL-10、TNF-α、IL-6、IL-1β非即用型ELISA檢測(cè)試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；所用其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器倒置光學(xué)顯微鏡(CKX41，OLYMPUS)；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(HERACELL150i，Thermo scientific)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H1650R，上海盧湘儀)；酶標(biāo)儀(SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司)。

1.3細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞，購(gòu)自贛州陽(yáng)明生物科技有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用將正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬瘤細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞濃度大約是4.8×105個(gè)/mL，每孔添加細(xì)胞混懸液100 μL，使用含100 mL·L-1FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，周邊保濕孔中添加200 μL 磷酸緩沖鹽溶液，37 ℃、5%CO2(V/V, 體積分?jǐn)?shù))條件下培養(yǎng)12 h，直到腫瘤細(xì)胞貼壁同時(shí)恢復(fù)到靜息狀態(tài)。將上述所用培養(yǎng)液吸棄，后面實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)液均為不含100 mL·L-1FBS的DMEM 高糖液體培養(yǎng)基。后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入不同成分作為不同實(shí)驗(yàn)組，100 μL/組，具體實(shí)驗(yàn)分組如下： ①對(duì)照組(CK):加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液； ②LPS組:在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中增添濃度是50 μg·mL-1的LPS母液，使LPS實(shí)驗(yàn)濃度是1 μg·mL-1； ③TUA組:在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為1 000 μg·mL-1的TUA母液，過(guò)0.22 μm濾膜，TUA組實(shí)驗(yàn)濃度各自是80、60、40、20、10、5 μg·mL-1，每組6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

以上各實(shí)驗(yàn)組都添加20 μL、濃度是5 mg·mL-1MTT，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄全部液體，保留貼壁腫瘤細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組都添加100 μL DMSO，搖床上振蕩10 min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上λ=520 nm處測(cè)定各孔OD值。

1.4.2 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

1.4.2.1 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響取正處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬瘤細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞密度大概是4.8×105個(gè)/mL，每孔添加細(xì)胞混懸液2 mL，使用含100 mL·L-1FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，周邊保濕孔中添加200 μL 磷酸緩沖鹽溶液，37 ℃、5%CO2(V/V, 體積分?jǐn)?shù))條件下培養(yǎng)12 h，直到腫瘤細(xì)胞貼壁同時(shí)恢復(fù)到靜息狀態(tài)。將上述所用培養(yǎng)液吸棄，后面實(shí)驗(yàn)采用不含胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液。在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入不同成分作為不同實(shí)驗(yàn)組，2 μL/組，具體實(shí)驗(yàn)分組如下： ①LPS組與對(duì)照組(CK):只添加DMEM(高糖)培養(yǎng)液； ②TUA給藥組:在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為1 000 μg·mL-1的TUA母液，過(guò)0.22 μm濾膜，TUA組實(shí)驗(yàn)濃度各自是20、10、5 μg·mL-1，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)6 h。

預(yù)處理后吸棄全部培養(yǎng)液，對(duì)照組添加DMEM(高糖)培養(yǎng)液；LPS組和TUA組均添加含LPS(終濃度為1 μg·mL-1)的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。在此培養(yǎng)過(guò)程中，分別在6、12、18、24 h時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用Griess試劑盒檢測(cè)各組樣品中NO含量。

1.4.2.2 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α影響細(xì)胞處理同1.4.2.1。分別在細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)6、12、18、24 h時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用非即用型ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組樣品中TNF-α含量。

1.4.2.3 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、IL-1β、IL-10影響細(xì)胞處理同1.4.2.1。分別在細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)24 h時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用非即用型ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組樣品中IL-6、IL-1β、IL-10含量。

2 結(jié) 果

2.1 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)TUA濃度不高于20 μg·mL-1時(shí)，在24 h內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞基本上無(wú)毒性作用，所測(cè)OD值與對(duì)照組(CK)、LPS組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，當(dāng)TUA濃度在60～100 μg·mL-1時(shí)，與對(duì)照組(CK)、LPS組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。其余試驗(yàn)中所用TUA劑量均在安全范圍內(nèi)(≤20 μg·mL-1)選取。

與對(duì)照組CK比，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO、TNF-α的影響表1所示，LPS組細(xì)胞通過(guò)致炎藥物干預(yù)12 h后，NO表達(dá)相比對(duì)照組升高(P<0.01)，并且NO表達(dá)在8～24 h內(nèi)與干預(yù)時(shí)間呈正相關(guān)。TUA組細(xì)胞采用不同濃度的TUA干預(yù)4 h，再經(jīng)LPS致炎12、16、24 h，各劑量TUA組的NO表達(dá)均顯著低于LPS組(P<0.01)，同時(shí)各時(shí)間-劑量點(diǎn)的NO表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。組間比較，LPS刺激8 h時(shí)，各組的NO表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 TUA對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO的影響

注：與對(duì)照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ##P<0.01。

如表2所示，LPS組細(xì)胞通過(guò)致炎藥物干預(yù)8 h后，TNF-α表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)，并且TNF-α表達(dá)在8～24 h內(nèi)與干預(yù)時(shí)間呈正相關(guān)。TUA組細(xì)胞采用不同濃度的TUA干預(yù)4 h，再經(jīng)LPS致炎12、16、24 h，各劑量組的TNF-α表達(dá)均顯著低于LPS組(P<0.01)，同時(shí)各時(shí)間-劑量點(diǎn)的TNF-α表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。從表2中還可以看出，TNF-α的表達(dá)在24 h內(nèi)呈劑量依賴性，即在用藥安全范圍內(nèi)，TUA的藥物濃度愈高，其抑制TNF-α表達(dá)的效果愈強(qiáng)。

表2 TUA對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

注：與對(duì)照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ##P<0.01。

2.3 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、IL-10的影響由圖2、圖3、圖4結(jié)果可知，LPS組細(xì)胞在致炎藥物干預(yù)24 h后，IL-1β、IL-6、IL-10的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。TUA組細(xì)胞采用不同濃度的TUA干預(yù)4 h，再經(jīng)LPS致炎24 h，TUA各劑量組的IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)均顯著低于LPS組(P<0.01)，且呈劑量依賴性，即在用藥安全范圍內(nèi)，藥物濃度越高，IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)越低；但與對(duì)照組相比，TUA各劑量組的IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)依然顯著升高(P<0.01)。

與對(duì)照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ## P<0.01。

與對(duì)照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ## P<0.01。

與對(duì)照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ##P<0.01。

圖4 TUA對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-10的影響

3 討 論

炎癥的定義為具有血液循環(huán)的活體組織由損傷因子誘發(fā)的機(jī)體防御性反應(yīng)，俗稱“發(fā)炎”。炎癥產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是局部的血管反應(yīng)，特征性地表現(xiàn)為炎癥部位的毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，組織通透性增加，繼而發(fā)生炎癥部位的水腫和炎性細(xì)胞的滲出[4]。RAW 264.7細(xì)胞是體內(nèi)巨噬細(xì)胞系的一種，其在機(jī)體的免疫系統(tǒng)激活過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。LPS是刺激機(jī)體發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)的一種很重要的激動(dòng)劑，LPS能夠促使機(jī)體多種細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞生成和表達(dá)大量的免疫致炎活性分子，并促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5]。NO是一種重要的炎癥介導(dǎo)因子，可在LPS的刺激下由巨噬細(xì)胞釋放，NO在炎癥產(chǎn)生的各個(gè)階段都發(fā)揮了非常重要的干預(yù)影響作用[6]。高濃度的NO可以刺激和促使致炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，TNF-α和IL-1β在炎癥反應(yīng)初始階段的表達(dá)就會(huì)顯著增高，二者在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了對(duì)細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的促進(jìn)作用[7]。TNF-α可刺激IL-6、IL-10等大量致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并且各因子之間可以通過(guò)相互作用形成正反饋，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的繼續(xù)加重[8]。

本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞作為體外炎癥模型來(lái)研究TUA的抗炎作用。實(shí)驗(yàn)中LPS的藥物劑量參照Park C M等[9]的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，并經(jīng)MTT試驗(yàn)驗(yàn)證，濃度為1 μg·mL-1的LPS在24 h內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞不產(chǎn)生藥理毒性作用，并確定了TUA的安全體外干預(yù)濃度為≤20 μg·mL-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的TUA均可極顯著地抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞后NO、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達(dá)(P<0.01)，且呈劑量依賴性。因此，本研究通過(guò)初步的體外抗炎試驗(yàn)證明，從獼猴桃根中分離得到的烏蘇烷化合物TUA具有較好的體外抗炎效果，但有關(guān)TUA更廣泛的抗炎效應(yīng)及作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。