夜來香根莖總黃酮超聲提取工藝*

張賽男，王妙飛，曾 靖，張 怡

(贛南醫(yī)學院 藥學院，江西 贛州 341000)

夜來香(Cestrum noctrnum，Linn)，又名夜香樹、夜香花、夜丁香、洋素馨，為茄科夜香樹屬植物，原產于南美洲[1-5]，在我國集中分布在南方的廣東、廣西、福建等地，每年開花約6次。夜來香最早被《中國高端植物圖鑒》[6]記載，其性溫味辛，入胃經，其功效有行氣止痛鎮(zhèn)定，用于治療胃脘痛。中國人為了觀賞、驅蚊和藥用有栽培夜來香的歷史[7-8]。其夜間盛開花朵氣味芬芳濃郁，常用來調配制成香精；它所含的揮發(fā)油成分有驅蚊的作用，所以又經常被制成驅蚊液等。夜來香的化學成分主要有揮發(fā)油類、皂苷類、黃酮類、多糖及酚類化合物等。

總黃酮的提取方法有很多，傳統(tǒng)的有機溶劑提取法存在著提取液量大、溶劑回收率低和成本高等缺點。本實驗擬采用水-乙醇為溶劑對夜來香根莖中總黃酮進行超聲提取，采用硝酸鋁顯色法測定總黃酮的得率[9-11]。現報告如下。

1 材料、儀器與試劑

1.1植物材料從江西省采集得到夜來香藥材。經過贛南醫(yī)學院程齊來教授的鑒定，是茄科夜香樹屬植物夜來香(Cestrum noctrnum，Linn)的根莖。取夜來香根莖烘干粉碎過篩后備用。

1.2試劑與儀器蘆丁標準品，購于成都普思生物科技股份有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，購于福晨(天津)化學試劑有限公司；超純水自制。

FWB5中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；BSA224S分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；KQ-500DB數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101-2-S-Ⅱ電熱恒溫古風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；UV-6100PCS紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Exceed-Ad-16艾柯實驗室超純水機，成都艾柯水處理設備有限公司。

2 方法和結果

2.1總黃酮的含量測定

2.1.1對照品溶液的制備萬分之一分析天平取10.00 mg蘆丁標準品，倒入50 mL容量瓶，倒70%乙醇到刻度線止，溶解均勻。制得濃度0.2 mg·mL-1的標準品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備稱取1.00 g夜來香根莖粉末，以料液比1∶20 g·mL-1加入70%乙醇，在超聲溫度30 ℃，超聲(500 W，40 kHz)提取30 min。供試品溶液即為用70%乙醇進一步補充失重的重量的過濾得到的濾液。

2.2夜來香根莖總黃酮含量測定

2.2.1溶液的顯色在比色管放入精準吸的2.5 mL樣品溶液。首先用70%乙醇添加到5 mL刻度線處，接著移入0.3 mL 5%亞硝酸鈉，混合靜放6 min。接著加入0.3 mL 10%硝酸鋁振搖均勻，混合靜放6 min。繼續(xù)加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液振搖均勻。最后用超純水添加到10 mL處，混合后靜放15 min。顯色完成。

2.2.2檢測波長的確定取對照品溶液和供試品溶液各2.5 mL，按照顯色方法進行顯色，顯色后掃描波長，蘆丁對照品溶液和夜來香根莖供試品溶液在510 nm處均有最大吸收波長，因此選擇510 nm為檢測波長。

2.2.3標準曲線的繪制精密量取蘆丁對照品溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL，按照“2.2.1”項下顯色后于UV分光光度計測定吸光度，其中0.0 mL對照品作為空白對照，以蘆丁吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：A=11.5C + 0.002 3，R2=0.999 9，樣品濃度在0.011 1～0.077 7 mg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。以蘆丁對照品吸光度(A)為縱坐標，濃度(C，mg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，標準曲線見圖1。

2.2.4夜來香根莖總黃酮得率的計算取2.5 mL夜來香根莖供試品，顯色后并測定吸光度。計算總黃酮的得率?？傸S酮得率(%)=夜來香根莖中總黃酮質量/夜來香根莖質量×100%。

2.3單因素實驗在其他條件均不變的條件下，研究料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)、乙醇濃度(20%、30%、40%、50%、60%、70%)和提取溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對夜來香根莖總黃酮提取的影響。

以70%乙醇為提取溶劑，選擇不同的料液比1∶15 g·mL-1、1∶20 g·mL-1、1∶25 g·mL-1、1∶30 g·mL-1、1∶35 g·mL-1、1∶40 g·mL-1進行提取，提取溫度為30 ℃，提取時間30 min。不同料液比對夜來香根莖總黃酮得率的影響結果見表1。

表1 不同料液比對夜來香根莖總黃酮得率的影響

選擇不同濃度的乙醇20%、30%、40%、50%、60%、70%進行提取，料液比為檢測結果最優(yōu)的1∶15 g·mL-1，提取溫度為30 ℃，提取時間30 min。不同乙醇濃度對夜來香根莖總黃酮得率的影響結果見表2。

以檢測結果最優(yōu)乙醇濃度30%為提取溶劑，料液比為1∶15 g·mL-1，選擇不同的提取溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃提取，提取時間30 min。不同提取溫度對夜來香根莖總黃酮得率的影響見表3。

表2 不同乙醇濃度對夜來香根莖總黃酮得率的影響

表3 不同提取溫度對夜來香根莖總黃酮得率的影響

2.4正交實驗優(yōu)選提取工藝在單因素實驗基礎上，設計L9(34)正交實驗，研究料液比、乙醇濃度、提取溫度對夜來香根莖總黃酮得率的影響。實驗因素與水平設計見表4。

表4 實驗因素與水平設計表

由表5可知，各因素對夜來香根莖中總黃酮得率的影響按大小依次排列，分別是提取溫度、料液比、乙醇濃度?？傸S酮最佳提取工藝組合是A3B1C3，即乙醇濃度為40%，料液比1∶25 g·mL-1，提取溫度為80 ℃，此工藝組合提取的夜來香根莖總黃酮含量最高。

表5 總黃酮正交實驗設計與結果

2.5總黃酮提取的方法學考察

2.5.1精密度考察精密吸取蘆丁對照品溶液2.5 mL，顯色完成后立即連續(xù)6次測定溶液的吸光度，蘆丁對照品吸光值RSD 0.29%，說明儀器精密度良好，結果見表6。

2.5.2穩(wěn)定性考察稱取夜來香根莖粉末1.0 g，按照優(yōu)選的最佳提取工藝進行提取顯色，顯色完成后立即測定吸光度，之后每隔10 min測一次吸光度，考察0～75 min內夜來香根莖總黃酮的穩(wěn)定性。夜來香根莖供試品顯色后在15～75 min內吸光度值RSD 0.42%，說明供試品顯色后在15～75 min內保持穩(wěn)定，因此，測定吸光度的時間為顯色后的15 min，結果見表7。

2.5.3重復性考察稱取夜來香根莖粉末1.0 g，按照優(yōu)選的最佳提取工藝進行提取顯色，顯色完成后立即測定吸光度，重復試驗6次，RSD 1.18%，說明此方法重復性良好，結果見表8。

表6 精密度考察結果

表7 穩(wěn)定性考察結果

表8 重復性考察結果

2.5.4加樣回收試驗稱取夜來香根莖粉末1.0 g，按照優(yōu)選的最佳提取工藝進行提取，得到夜來香根莖待測液，加入和夜來香根莖中總黃酮含量相當的的蘆丁對照品溶液，按照顯色方法進行顯色，顯色完成后測定其吸光度，重復試驗6次，計算得蘆丁的平均加樣回收率為92.00%，加樣回收率的RSD 0.66%，說明此方法測定結果準確可靠，結果見表9。

表9 加樣回收試驗結果

3 討 論

超聲輔助提取是又快速又有效并且還環(huán)保的提取方法。為了能更大的減少提取時間，本實驗充分利用超聲波引起的強烈振動，空化和粉碎，提高夜來香根莖總黃酮的提取效果。通過實驗結果可知夜來香根莖總黃酮的最佳工藝為超聲提取。夜來香根莖總黃酮得率為0.135%。該方式簡單且行之有效，不僅重復性好而且回收率高，不失為提取夜來香根莖總黃酮較為理想的方法。為夜來香根莖總黃酮的提取提供了可行依據。