慢性乙型肝炎患者天然免疫相關(guān)基因表達(dá)差異研究

曹蓉 杜阿妮

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染引起的慢性乙型肝炎(CHB)是全球最常見(jiàn)的肝病之一。HBV慢性感染是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，其自然病程分為三個(gè)階段[1]：免疫耐受期(慢性HBV攜帶者)，免疫活性期(HBeAg陽(yáng)性CHB和HBeAg陰性CHB)和非活動(dòng)期(非活動(dòng)性HBsAg陰性CHB者)。在CHB不同進(jìn)展階段，機(jī)體天然免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)也會(huì)隨疾病進(jìn)展而發(fā)生改變。本研究檢測(cè)不同階段CHB患者外周血單核細(xì)胞中干擾素(interferons，IFNs)及其受體(interferon receptors，IFNR)、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors, IRFs)、Toll樣受體(TLRs)和干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2017年6月至2018年6月在西安高新醫(yī)院收治的自然發(fā)展CHB患者174例，男性95例，女性79例，年齡21～50歲，平均年齡(37.5±13.4)歲。CHB診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》標(biāo)準(zhǔn)[2]。根據(jù)該診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入的CHB患者慢性HBV患者48例(A組)，HBeAg陽(yáng)性CHB患者44例(B組)，HBeAg陰性CHB患者40例(C組)，非活動(dòng)性HBsAg陰性CHB者42例(D組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒共感染者；②其他肝損傷患者；③妊娠期及哺乳期婦女。另外，選擇健康者40例(H組)，男性22例，女性18例，年齡20～50歲，平均年齡(35.5±15.6)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

二、研究方法

(一)主要儀器與試劑 臺(tái)式低速離心機(jī)(德國(guó)，sigma公司)，超凈工作臺(tái)(中國(guó)，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)，Thermo公司)，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis 試劑盒(美國(guó)，Thermo 公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)，ABI 公司)，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國(guó)，Applied Biosystems公司)，目的基因引物(中國(guó)，上海生工生物工程公司)。

(二)人外周血單核細(xì)胞分離 研究對(duì)象外周全血(10 mL)收集到含有EDTA的抗凝血管中。將外周血1∶4稀釋后緩慢加入事先裝有人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，室溫離心2 500×g，20 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，洗滌離心后用DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄培養(yǎng)液，得到貼壁的外周血單核細(xì)胞。

(三)RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) 使用TRIzol試劑提取外周血單核細(xì)胞總RNA。用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis 試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)cDNA中目的基因的含量。目的基因引物參考文獻(xiàn)[3-6]。以人β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)源對(duì)照，與健康對(duì)照組(H組)比較，采用2-ΔΔCt法檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)。所有操作均參照對(duì)應(yīng)產(chǎn)品說(shuō)明書，所有操作均由經(jīng)過(guò)技術(shù)培訓(xùn)及質(zhì)量考核的同一個(gè)操作者完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、四組基本資料情況比較

四組年齡、ALT、HBV DNA、HBeAg差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四組性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組臨床參數(shù)比較

二、IFN及其受體基因mRNA表達(dá)水平變化

五組IFN及其受體基因mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。A、B、C、D組IL10RB、IFN均顯著高于H組(P<0.05)；A、B、C、D組均低于H組(P<0.05)。A組顯著高于其他組(P<0.05)；A組顯著低于其他組(P<0.05)；A組顯著高于B和D組(P<0.05)；B組IFN顯著高于A、C和D組(P<0.05)；A組IFN顯著高于D組(P<0.05)。

三、IRF基因mRNA表達(dá)水平變化

五組IRF基因mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。A、B、C、D組IRF7、IRF9均顯著高于H組(P<0.05)。A組和C組IRF4分別顯著高于B和D組(P<0.05)；A組IRF5顯著高于B和D組(P<0.05)；D組IRF8顯著高于H組(P<0.05)；C組IRF9顯著高于其他組(P<0.05)。

四、TLR基因mRNA表達(dá)水平變化

五組TLR基因mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。A、B、C、D組TLR4顯著高于H組(P<0.05)。A組TLR2顯著高于B和D組(P<0.05)；A組TLR8顯著高于B和D組(P<0.05)；D組IRF8顯著高于H組(P<0.05)；C組IRF9顯著高于其他組(P<0.05)。

五、干擾素誘導(dǎo)基因mRNA表達(dá)水平變化

五組干擾素誘導(dǎo)基因mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。A、B、C、D組MYD88顯著高于H組(P<0.05)。A組和B組JAK1均顯著高于D組(P<0.05)；C組RIG1顯著高于B和D組(P<0.05)；A組RIG1顯著高于D組(P<0.05)；C組TRIF顯著高于其他組(P<0.05)；A組TRIF顯著高于D組(P<0.05)；C組TRAF6顯著高于B和D組(P<0.05)；B組IRAK1顯著低于C和D組(P<0.05)；C組MAVS顯著高于B和D組(P<0.05)。

表2 IFN及其受體基因mRNA表達(dá)水平比較

表3 IRF基因mRNA表達(dá)水平比較

表4 TLR基因mRNA表達(dá)水平比較

表5 干擾素誘導(dǎo)基因mRNA表達(dá)水平比較

六、天然免疫相關(guān)基因表達(dá)水平總體變化

在檢測(cè)的共31個(gè)基因中，A組有20個(gè)基因相對(duì)表達(dá)高于H組2.5倍以上，B組11個(gè)，C組19個(gè)，D組8個(gè)，四組相對(duì)表達(dá)增加2.5倍以上基因數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.605，P=0.003)，A組和C組表達(dá)增加基因數(shù)量較多。A組只有1個(gè)基因相對(duì)表達(dá)低于H組0.5倍以上，B組9個(gè)，C組2個(gè)，D組13個(gè)，四組相對(duì)表達(dá)低于0.5倍以上基因數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.790，P=0.001)，B組和D組表達(dá)下降基因數(shù)量較多。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染四個(gè)階段患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的先天免疫系統(tǒng)差異表達(dá)。Vanwolleghem等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，不同HBV臨床進(jìn)展期患者具有不同的免疫特征，天然免疫干擾素表達(dá)和適應(yīng)性免疫B細(xì)胞應(yīng)答分別在免疫耐受期和免疫活動(dòng)期顯著增加。與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫耐受階段和免疫活動(dòng)期的HBeAg陰性CHB患者天然免疫相關(guān)基因表達(dá)增加數(shù)量較多，免疫非活動(dòng)期則顯示出天然免疫相關(guān)基因下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒水平較低時(shí)，天然免疫應(yīng)答反而可以促進(jìn)而不是抑制HBV復(fù)制[8]。本研究在DNA水平最低的免疫非活動(dòng)期觀察到較低的天然免疫應(yīng)答，這可能是一些慢性乙型肝炎患者再激活的原因之一，將來(lái)需要進(jìn)一步闡明天然免疫在慢性感染再激活過(guò)程中的作用機(jī)制。

有研究表明，抑制HBV病毒復(fù)制未發(fā)現(xiàn)IFN-α、IFN-β、IFN-λ、TNF-α和IL-6的大量表達(dá)[9]。但是HBV感染可誘導(dǎo)原代人肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系產(chǎn)生IFNλ(III型干擾素)[10]。與前人結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)在CHB的所有臨床階段，HBV感染都不能引起I型和II型干擾素的大量產(chǎn)生，但確實(shí)誘導(dǎo)了IFNλ的產(chǎn)生。這說(shuō)明I型和II型IFN未被誘導(dǎo)或僅在CHB患者的PBMC中以非常低的水平誘導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)與IRF7在CHB的所有臨床階段的IRF中表達(dá)最高，但I(xiàn)RF7在低病毒載量的免疫非活動(dòng)期表達(dá)增加最少。Momeni等研究認(rèn)為是IRF7的表達(dá)降低，而不是NF-kB，是導(dǎo)致CHB患者HBV持續(xù)存在的主要機(jī)制[11]。在高水平的病毒載量下，CHB患者IRF7 表達(dá)并未完全降低。本研究發(fā)現(xiàn)在免疫非活動(dòng)期(最低的HBV DNA水平)TLR基因表達(dá)水平均較低，其具有最低的HBV DNA水平，TLR表達(dá)可能與病毒DNA載量有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在臨床早期階段JAK1表達(dá)增加，這可能與IFN-λ及其受體IL10RB的高表達(dá)有關(guān)。研究表明與健康對(duì)照組相比，CHB患者的MDA5和RIG-I mRNA水平顯著降低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDA5和RIG-1在不同的CHB階段具有不同的mRNA表達(dá)水平，并且在一些情況下，這些mRNA水平的改變顯著。本研究觀察到免疫非活動(dòng)期RIG-1和MDA5低表達(dá)，說(shuō)明RIG-1和MDA5低表達(dá)可能與HBeAg消失和病毒載量減少有關(guān)。

總之，本研究表明與免疫活動(dòng)期(HBeAg陽(yáng)性CHB患者)和免疫非活動(dòng)期相比，免疫耐受期和HBeAg陰性CHB患者PBMC中檢測(cè)的天然免疫基因的表達(dá)大量增加。天然免疫應(yīng)答基因在慢性HBV期之間差異表達(dá)，這種差異可能有助于開(kāi)發(fā)新的更加精確和非侵入性方法來(lái)確定患有慢性HBV患者的疾病進(jìn)展，或定義新的CHB臨床階段。