留蘭香油的化學(xué)組成及其抗氧化、抗菌性能的測(cè)定

張曜 / 必維申美商品檢測(cè)（上海）有限公司

0 引言

留蘭香（Mentha spicata L.）是重要的藥用植物，屬唇性科薄荷屬植物，具有強(qiáng)烈的芳香氣味，異名綠薄荷。留蘭香的化學(xué)組成主要包括香芹酮、檸檬油精、二氫黃蒿萜酮、樟腦萜、乙酸二氫香芹酯和β-石竹烯。這類揮發(fā)性油由于其獨(dú)特的香味和風(fēng)味被廣泛應(yīng)用于食品、藥品及化妝品。

1 留蘭香油的功效

1.1 天然抗氧化劑

抗氧化劑是一種能延長(zhǎng)油品氧化反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，減緩油品氧化速度，延長(zhǎng)油品使用壽命的抑制劑。它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對(duì)人體損害的一類物質(zhì)。現(xiàn)在，即使有許多可以抑制氧自由基反應(yīng)發(fā)生的人工合成的抗氧化性物質(zhì)，由于安全性和潛在的毒性作用等方面的欠缺，合成抗氧化劑的使用越來越多地受到限制。因而，近年來從天然植物中探索或?qū)ふ野踩愿叩奶烊豢寡趸镔|(zhì)，引起了許多學(xué)者的關(guān)注[1]。

1.2 天然抗菌劑

抗菌劑，是指一類用來防治各類病源微生物引起植物病害的藥劑，對(duì)病原微生物有殺死作用或抑制生長(zhǎng)作用。常見的抗菌劑都是一些化工產(chǎn)品，如果直接運(yùn)用于人們的日常生活將對(duì)身體產(chǎn)生一定的危害。留蘭香油作為天然的植物提取物抗菌劑，將受到消費(fèi)者的日益青睞。

1）微生物的培養(yǎng)溫度

不同菌種所適合的培養(yǎng)溫度都不一樣，有些溫度適合細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)，有些則抑制其生長(zhǎng)，更可能會(huì)導(dǎo)致菌的死亡。細(xì)菌一般適宜溫度是37 ℃，霉菌與酵母的一般培養(yǎng)溫度則為27 ℃左右。

2）微生物的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動(dòng)物組織生長(zhǎng)和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。測(cè)最小抑菌濃度（MIC），由于是在96 孔板中測(cè)試，故所需培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。而在測(cè)最小殺菌濃度（MBC）時(shí)，由于使用的是涂布平板法，故需要的是固體培養(yǎng)基，但所有的培養(yǎng)基也必須適合所培養(yǎng)的微生物，所以最終選用了適合菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和適合真菌用培養(yǎng)基：馬鈴薯液體培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 平板連續(xù)稀釋法與微量稀釋法

目前大多數(shù)的藥物敏感試驗(yàn)使用的是微量稀釋法和紙片法。兩種方法各自存在優(yōu)缺點(diǎn)，紙片法價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)便、抗生素選擇靈活，但是紙片法只是定性試驗(yàn)，且只能用于測(cè)試快速生長(zhǎng)的細(xì)菌；而微量稀釋法雖價(jià)格較昂貴，但操作簡(jiǎn)便，所以選用微量稀釋法來測(cè)定最小抑菌濃度。

涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計(jì)算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長(zhǎng)形成菌苔的特點(diǎn)用于檢測(cè)化學(xué)因素對(duì)微生物的抑殺效應(yīng)，所以選用平板涂布法來測(cè)定最小殺菌濃度。

2 材料和方法

2.1 材料

留蘭香油（薄荷油），上海蘋果香精香料有限公司；乙醇，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）公司；二甲基亞砜（DMSO），中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）公司；吐溫80，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）公司；胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉湯(培養(yǎng)基)TSB，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）公司；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA），中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）公司；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）公司；DPPH，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；鐵氰化鉀，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）公司；MTT（氯丁膠新型交聯(lián)劑），Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密蘇里州，美國(guó)） ；INT（碘硝基四唑紫溶液），Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密蘇里州，美國(guó)）；胎牛血清（FBS），Invitrogen（USA）；高純氦氣，上海彭浦液化空氣有限公司。

2.2 儀器和設(shè)備

GC-MS，5973N，安捷倫科技，美國(guó) ；氣相色譜柱，HP-5，安捷倫科技，美國(guó)；

LRH-250 全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2D/2G 垂直流超凈工作臺(tái)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TS-200B 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZM-80KCS-ii立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；752N 紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA2104 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SB4200DT 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S11-2-S 型電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CT14RD 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司。

2.3 方法

2.3.1 化學(xué)組成的測(cè)定

留蘭香油中薄荷醇的平均含量是Ruimin Lin 等用GC-MS 的方法測(cè)定而得。參考這個(gè)方法，用GCMS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）來分析綠留蘭香油的化學(xué)組成，其中氣相色譜柱是采用HP-5 型號(hào)的毛細(xì)管色譜柱。柱溫箱的起始溫度控制在60 ℃，保持3 min，升溫梯度以 3 K/min 升至 240 ℃，采用恒流模式，柱流量是 1 mL/ min，進(jìn)樣量是 0.2 μL，分流比是20 ∶1。質(zhì)譜的離子源采用電子電離源，電子能量是70 eV，四級(jí)桿的溫度是150 ℃，離子源溫度230 ℃，電子倍增器的電壓不高于2 200 V，質(zhì)譜連接處的溫度是250 ℃，溶積延遲3 min，質(zhì)量數(shù)采集區(qū)間為：40～550。

2.3.2 抗氧化活性

2.3.2.1 DPPH 法

DPPH（2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基）檢測(cè)方法通常要涉及氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，但是，考慮到動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，一個(gè)電子的轉(zhuǎn)移機(jī)制也已經(jīng)建立了這個(gè)方法。綠留蘭香油上的自由基的活性清除是根據(jù)分光光度法來測(cè)定的，它是通過計(jì)算減少DPPH 的乙醇溶液而得。

按照Williams 等人的方法，準(zhǔn)確稱取DPPH 試劑 0.039 4 g，用無水乙醇溶解定容至 100 mL 容量瓶中，得濃度為1 mmol/L 的DPPH 儲(chǔ)備液，搖勻置于冰箱中冷藏備用。臨用前用無水乙醇稀釋至濃度為0.2 mmol/L 即可。分別取 1.5 mL 各濃度的留蘭香油乙醇液置于不同的4 mL 比色管中，再加入1.5 mL，0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，待反應(yīng)結(jié)束，同時(shí)需要在合適的溫度下放在暗處60 min。然后分別測(cè)定各混合液在518 nm 處吸光值。每一個(gè)樣品平行測(cè)三次，取平均值，測(cè)定DPPH 自由基清除率。

DPPH 溶液中抑制自由基的計(jì)算方法如下：

式中：Ablank—— 空白反應(yīng)的吸光度；

Asample—— 測(cè)試樣品的吸光度

用IC50表達(dá)抗氧化活性。IC50定義為抗氧化劑需要降低到最初DPPH 濃度的50%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。

2.3.2.2 還原力的檢測(cè)

綠留蘭香油的還原力是用PRUSSIAN BLUE（普魯士藍(lán)）方法檢測(cè)的。取1 mL 不同濃度待測(cè)樣品于試管中，依次加入 2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L PBS，pH 6.6）和 2.5 mL，1%六氰合鐵酸鉀溶液 [K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴保溫20 min 后，快速冷卻，再加入 2.5 mL，10% 三氯乙酸 (TCA)，以 3 000 r/min 離心 10 min，取上清液 5.0 mL，依次加入 5.0 mL 蒸餾水，1.0 mL，0.1%的三氯化鐵（FeCl3）溶液，充分混勻，靜置10 min。反應(yīng)混合物在700 nm 處測(cè)定其吸光值，以蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，每一樣品濃度平行測(cè)三次，取平均值。

2.3.3 抗菌活性的測(cè)定

2.3.3.1 菌種的制備

所用菌株在實(shí)驗(yàn)的前一天晚上，在37 ℃的條件下培養(yǎng)。選出典型的菌落接種到TSB 液體培養(yǎng)基，并在37 ℃條件下培養(yǎng)18 h。由于桔青霉菌和黑曲霉素是真菌，所以其培養(yǎng)溫度是27 ℃。之后用平板細(xì)菌計(jì)數(shù)方法測(cè)定它們生長(zhǎng)的混濁度，剩下的混懸液稀釋至細(xì)菌群落總數(shù)在 1×105～ 1×106CFU/mL。如果是真菌，完整的細(xì)菌被孢子取代，故需挑起孢子來制成孢子混懸液。孢子混懸液的含菌量也稀釋至1×105～ 1×106CFU/mL，用于 CBC 平板細(xì)菌計(jì)數(shù)方法[6]。

2.3.3.2 測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）

在96 孔聚苯乙烯板中，加入100 μL 不同濃度的留蘭香油，使用5%吐溫80 作為溶劑，每孔依次加入 100 μL 培養(yǎng)基和 50 μL 菌液，測(cè)試油的最終濃度分別為（400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5）μL /mL。96 孔板，用膠帶封好，以減少油揮發(fā)。并準(zhǔn)備了陰性對(duì)照（含5%吐溫80 的油和培養(yǎng)基）和陽(yáng)性對(duì)照（只含5%吐溫80 的微生物培養(yǎng)基）。細(xì)菌懸浮液的微孔板在37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌混懸液須在27 ℃培養(yǎng)48 h。最后，在每個(gè)小孔中加入 40 μL 的 INT 溶液（溶解 INT，H2O ∶ C2H5OH 按1 ∶ 1 制成 50 mg/mL），測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）。因?yàn)镸IC 為樣品細(xì)菌未能增長(zhǎng)的最低濃度，所以在培養(yǎng)基中沒有被檢測(cè)到有明顯的變化即可[7]。

為了評(píng)估最小殺菌濃度（MBC），在沒有加入INT 的條件下重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。100 μL 沒有被檢測(cè)到有明顯變化的被檢液涂布到瓊脂培養(yǎng)基平板上，觀察其微生物的生長(zhǎng)情況。細(xì)菌板在37 ℃培養(yǎng)48 h，而有真菌的須于27 ℃培養(yǎng)72 h。MBC 是細(xì)菌未能成長(zhǎng)在這個(gè)平板上的最低濃度。所有的實(shí)驗(yàn)須平行測(cè)試三次。

2.3.4 細(xì)胞毒性的測(cè)定

綠留蘭香油的海拉細(xì)胞有細(xì)胞毒性，可用MTT方法[8-10]檢測(cè)。海拉細(xì)胞的接種方法是每5 000 個(gè)細(xì)胞接種到含有200 μL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的96 孔板中，培養(yǎng)24 h，等到有80%的覆蓋密度，才能用于檢測(cè)。然后把原培養(yǎng)基用新鮮的無血漿培養(yǎng)基來代替，再放入連續(xù)稀釋的不同濃度的綠留蘭香油。細(xì)胞在孵育72 h 后需要把培養(yǎng)基換成新的生長(zhǎng)培養(yǎng)基再加入20 μL 的 MTT。再需要培養(yǎng) 4 h，隨后加入 150 μL 的DMSO，之后就可以在570 nm 處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。細(xì)胞的活力度就是通過這些數(shù)據(jù)計(jì)算而得。

細(xì)胞的活力度通過下列公式計(jì)算而得：

式中：Atest—— 綠留蘭香油中處理過的細(xì)胞的吸光度；

Acontrol—— 綠留蘭香油沒有處理過的細(xì)胞的吸光度

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 化學(xué)組成的測(cè)定

揮發(fā)性油已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和制藥行業(yè)，因此，現(xiàn)在各種芳香植物揮發(fā)性油的生物活性研究已經(jīng)是有吸引力的研究領(lǐng)域之一。這項(xiàng)研究評(píng)估了在中國(guó)研究留蘭香油的化學(xué)成分和生物活性。通過面積歸一化法，對(duì)留蘭香油的主要揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，留蘭香油的GC-MS 分析結(jié)果列于表1。在研究留蘭香油中被鑒定出的21 種化合物占總油的97.10%。揮發(fā)性油中主要成分是香芹酮（65.33%），檸檬油精（18.19%），二氫黃蒿萜酮（2.97%），樟腦萜（2.34%），乙酸二氫香芹酯（1.54%）和β-石竹烯（1.12%）。關(guān)于留蘭香油成分的已發(fā)表的報(bào)道相對(duì)較少。

表1 留蘭香油的化學(xué)成分

3.2 抗氧化活性的測(cè)定

3.2.1 DPPH 測(cè)試

留蘭香油其潛在的抗氧化活性通過2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）測(cè)定方法來篩選。DPPH是一個(gè)穩(wěn)定的自由基，可以很容易地發(fā)現(xiàn)一種抗氧化劑存在的減少。這表明在518 nm 有最大的紫外線和可見光（UV-VIS）吸光度。首先，得出了一個(gè)結(jié)論，留蘭香油自由基的清除反應(yīng)是在反應(yīng)開始50 min 后穩(wěn)定的（圖1）。之后，使用不同濃度的留蘭香油，以測(cè)試其DPPH 自由基清除能力并發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度高于189.7 mg/mL 時(shí)，其清除自由基能力停止大幅增加，并保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平。所以，選擇留蘭香油濃度從27.1～189.7 mg/mL，以確定其準(zhǔn)確的IC50。結(jié)果表明，在控制劑量和時(shí)間條件下，留蘭香油能有效和快速地抑制DPPH 自由基的形成，表明有效的抗氧化劑活性（圖2）。在這項(xiàng)研究中，留蘭香油有去清除DPPH 自由基的能力是在濃度為50%抑制濃度（IC50）的基礎(chǔ)上確定的。留蘭香油的IC50值作為清除能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定為72.07±0.34 mg/mL。

圖1 加入留蘭香油后抑制DPPH 自由基的變化，數(shù)據(jù)表示為平均值（N = 3）

圖2 DPPH 自由基清除率和留蘭香油的濃度之間的線性相關(guān)，數(shù)據(jù)表示為平均值（N = 3）

3.2.2 還原力的測(cè)定

通過在還原力的檢測(cè)中，可以發(fā)現(xiàn)隨著測(cè)試樣品活性下降的增加使反應(yīng)混合液的吸光度也增加（圖3）?？寡趸衔镆?yàn)樗鼈兊倪€原能力導(dǎo)致鐵（Fe3+）還原成亞鐵（Fe2+）的形態(tài)。普魯士藍(lán)有色絡(luò)合物的形成是由于加入的三氯化鐵還原成亞鐵（Fe2+）的形態(tài)。因此，通過測(cè)量在700 nm 處形成普魯士藍(lán)可以決定是否具有還原性。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)溶液由黃色改為綠色或藍(lán)色取決于抗氧化樣品的還原力。吸光度較高表明較高的還原能力。留蘭香油的濃度從27.1mg/mL 增加至189.7 mg/mL 顯示較大的劑量反應(yīng)的效果。上述結(jié)果表明，作為一種有效的天然抗氧化劑，留蘭香油值得更多的研究。

圖3 吸光度和留蘭香油的濃度之間的線性相關(guān)，數(shù)據(jù)表示為平均值（N = 3）

3.3 抗菌活性的測(cè)定

3.3.1 留蘭香油的抑菌效果

由表2 可以看出，留蘭香油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母、桔青霉素、黑曲霉素都具有一定的抑制作用，但抑菌作用的大小不同，其順序?yàn)椋横劸平湍福敬竽c桿菌＞桔青霉素＞黑曲霉素＞金黃色葡萄球菌。

3.3.2 留蘭香油的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）

通過留蘭香油抑菌和殺菌濃度的測(cè)定，獲得抗菌性能的精確數(shù)據(jù)。表2 顯示了他們對(duì)5 種微生物測(cè)試的最低抑菌濃度（MIC；μL/mL）和最低殺菌濃度（MBC；μL/mL）。表2 顯示，留蘭香油對(duì)所有被測(cè)試微生物有抑菌和殺菌效果。

它對(duì)于抗大腸桿菌、啤酒酵母和桔青霉素是非常有效的。啤酒酵母對(duì)留蘭香油較為敏感（MIC 0.781 25 μL/mL）。MBC 的評(píng)價(jià)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。Aggarwal 和其他人（2002 年）對(duì)留蘭香（主要成分是檸檬27.3%和56.6%香芹酮）從隔離油成分的抗菌活性進(jìn)行了評(píng)估。香芹酮被測(cè)試出抗廣泛的人類致病真菌和細(xì)菌。因此，留蘭香油的抗菌活性高，可能是由于香芹酮含量高。但是Aggarwal 和其他人（2002）沒有評(píng)價(jià)香芹酮對(duì)啤酒酵母的抗性。

表2 留蘭香油的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）/μL·mL-1

4 結(jié)語(yǔ)

植物次生代謝產(chǎn)物，一般顯示了顯著的生物活性，如抗氧化、抗菌。而留蘭香油的應(yīng)用領(lǐng)域無疑可以擴(kuò)大，如它顯示的生物活性。因此，用GC-MS和常見的實(shí)驗(yàn)方法研究綠留蘭香油的化學(xué)成分，然后評(píng)估其生物活性，包括抗氧化、抗菌。結(jié)果可提供給食品、化妝品和制藥行業(yè)使用的綠留蘭香油其潛在的抗氧化、抗菌性能。許多植物精油對(duì)病菌具有抑制作用，且有許多都已經(jīng)被開發(fā)利用作為天然的防腐劑，但不少都是粗制品，其中的有效成分含量不穩(wěn)定，有時(shí)會(huì)隨著環(huán)境及季節(jié)的變化而改變，所以該研究也為探索或?qū)ふ野踩愿叩奶烊环栏瘎?、天然抗氧化物質(zhì)提供了重要的依據(jù)。