QuEChERS-液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中3種農(nóng)藥及其代謝物殘留

孫明娜 余璐 王雯雯 王梅 董旭 童舟 褚玥 楊通 高同春 段勁生

摘要[目的]建立同時(shí)檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。[方法]樣品用乙腈提取，經(jīng)C?18凈化，采用UPLC-MS/MS檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法進(jìn)行定量。[結(jié)果]在5種基質(zhì)（糙米、面粉、玉米、白菜、蘋果）中，農(nóng)藥及代謝物在0.005～0.500 mg/L線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.996，定量限均小于10 μg/kg。在0.01、?0.10和1.00 mg/kg添加水平下，平均回收率為71.2%～105.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.28%～16.70%。[結(jié)論]該方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，可用于農(nóng)產(chǎn)品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留的同時(shí)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞QuEChERS;UPLC-MS/MS;農(nóng)藥殘留;農(nóng)產(chǎn)品;代謝物

中圖分類號(hào)TQ?450.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0211-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.059

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Simultaneous Determination of Three Pesticides and Their Metabolite Residues in Agricultural Products by-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Ming-na1，YU Lu1，WANG Wen-wen2 et al（1.Institute of Plant Protection and Agricultural Product Quality Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Agricultural Product Quality and Safety Risk Assessment Laboratory of Ministry of Agriculture and Rural Agriculture （Hefei），Hefei，Anhui 230031;2.Anhui Jianghuai Horticultural Seed Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230000）

Abstract[Objective]The research aimed to establish a method of simultaneous detection of phorate，prothioconazole and fipronil and its metabolite residues in agricultural products by QuEChERS-UPLC-MS/MS.[Method]The samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up by C?18，determined by UPLC-MS/MS and quantified by the matrix-matched external standard method.[Result]The calibration curves were linear in the range of 0.005-0.500 mg/L with the correlation coefficients larger than 0.996，the limits of quantitation were less than 10 μg/kg in five different matrix （brown rice，wheat flour，maize，Chinese cabbage，apple）.The mean recovery of 9 pesticides were 71.2%-105.0% and the relative standard deviation （RSD） was 1.28%-16.70% at 0.01，0.10 and 1.00 mg/kg with hree spiked levels.[Conclusion]The sensitivity，accuracy and precision of the method meet the requirements of pesticide residue analysis，and can be used for simultaneous detection of phorate，prothioconazole and fipronil and their metabolite residues in agricultural products.

Key wordsQuEChERS; UPLC-MS/MS; Pesticide residues;Agricultural products;Metabolites

甲拌磷是高毒廣譜內(nèi)吸性殺蟲劑，主要用于防治地下害蟲、蚜蟲等。甲拌磷在自然條件下經(jīng)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生毒性更大的2種代謝物甲拌磷砜和甲拌磷亞砜。甲拌磷砜和甲拌磷亞砜在環(huán)境中比較穩(wěn)定，其殘留期比甲拌磷長(zhǎng)[1]。丙硫菌唑是新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑，廣泛應(yīng)用于谷類、麥類、豆類農(nóng)產(chǎn)品中，對(duì)麥類病害有很好的防效，其在作物中的主要代謝物是其脫硫產(chǎn)物硫酮菌唑[2]。氟蟲腈是苯基吡唑類殺蟲劑，可用于防除鱗翅目和直翅目害蟲以及地下鞘翅目害蟲的幼蟲。在氟蟲腈施用于作物的過程中，主要代謝產(chǎn)物有氟蟲腈硫醚（MB 45950）、氟蟲腈砜（MB 46136）、氟甲腈 （MB 46513），都有一定毒性，有的甚至高于母體[3]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中最大農(nóng)藥殘留限量》中規(guī)定了甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈在食品中的最大殘留限量，并且殘留量均包括農(nóng)藥母體和其代謝物之和。然而，標(biāo)準(zhǔn)中推薦的檢測(cè)方法并不完全覆蓋農(nóng)藥母體及其代謝物，如檢測(cè)甲拌磷的標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T5009.20—2003只檢測(cè)甲拌磷，不檢測(cè)甲拌磷砜和甲拌磷亞砜;檢測(cè)氟蟲腈的標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 1982—2007和NY/T 1379—2007都僅僅檢測(cè)氟蟲腈不包括其代謝物。丙硫菌唑暫無國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法。由于甲拌磷、丙硫菌唑、氟蟲腈及代謝物殘留能同時(shí)檢測(cè)的方法缺失，造成農(nóng)產(chǎn)品中檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)和殘留判定標(biāo)準(zhǔn)的不一致。另一方面，上述3種農(nóng)藥及其代謝物需要在不同方法的不同儀器中檢測(cè)，方法繁瑣，檢測(cè)效率低。因此，建立快速準(zhǔn)確的農(nóng)產(chǎn)品中甲拌磷、丙硫菌唑、氟蟲腈及其代謝物的測(cè)定方法尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)檢測(cè)甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈的主要方法有液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6-8]、氣相色譜質(zhì)譜法[9-10]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15]。甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈殘留量檢測(cè)方法的研究雖然報(bào)道較多，但多以水果、蔬菜中的測(cè)定方法為主。目前有關(guān)農(nóng)產(chǎn)品中同時(shí)檢測(cè)甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物的快速測(cè)定方法鮮見報(bào)道。QuEChERS 是一種快速、簡(jiǎn)單、高效、廉價(jià)的樣品前處理方法，已廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、谷物等低脂肪類基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的測(cè)定[16-18]。筆者建立基于QuEChERS方法的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留量的方法，以期為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)工作提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1供試藥劑3種農(nóng)藥及其代謝物（以下簡(jiǎn)稱9種化合物）標(biāo)準(zhǔn)品均購于美國(guó)Achemtek公司;C?18吸附劑購于天津博納艾杰爾科技有限公司;氯化鈉為分析純，購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，購于美國(guó)TEDIA公司;乙酸銨、甲酸為色譜純，購于美國(guó)aladdin公司。

1.2儀器ACQUITY 超高效液相色譜-Xevo TQ-S 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）;渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）;ZB-85氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）;HC-3018高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.3前處理方法

稱取5.0 g勻漿樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水、10 mL乙腈，振蕩1 h，再加入3 g 氯化鈉，渦旋1 min，以4 500 r/min離心5 min。取2 mL上層提取液于含有50 mg C?18和150 mg無水硫酸鎂的10 mL離心管中，渦旋1 min，以7 000 r/min離心5 min，取上清液過 ?0.22 μm 微孔膜過濾供UPLC-MS/MS分析。

1.4儀器條件

1.4.1液相色譜條件。色譜柱為 Waters CORTECS UPLC C?18（粒徑1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液;B為甲醇;流速0.25 mL/min;進(jìn)樣體積5 μL;柱溫40 ℃;洗脫方式為梯度洗脫，洗脫程序如下：0～?1 min，5% B相～40% B相;1～3 min，40% B ～80% B相;3～?5 min，80% B相～5% B相;5～6 min，5% B相。

1.4.2質(zhì)譜條件。毛細(xì)管電壓為0.5 kV;離子源溫度?150 ℃;去溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)?，去溶劑氣流速?1 000 L/h;錐孔電壓4 V;碰撞氣為高純氬氣。3種農(nóng)藥及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

1.5.1農(nóng)藥單標(biāo)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg）分別置于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，分別配成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液，于4?℃避光保存。

1.5.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。根據(jù)單標(biāo)濃度，準(zhǔn)確量取適量單標(biāo)溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，于4?℃避光保存。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別用乙腈、糙米空白基質(zhì)溶液、面粉空白基質(zhì)溶液、玉米空白基質(zhì)溶液、白菜空白基質(zhì)溶液和蘋果空白基質(zhì)溶液稀釋，配制成0.001、0.005、0.010、0.050、?0.100和0.500 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4”條件測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，外標(biāo)法定量。

1.7添加回收試驗(yàn)

分別在空白樣品中添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.01、0.10和1.00 mg/kg，每個(gè)水平重復(fù)5次。按“1.3”和“1.4”的步驟進(jìn)行樣品前處理和分析測(cè)定，并設(shè)空白對(duì)照。計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.8基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估方法基質(zhì)效應(yīng)（ME）按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1）×100%

|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，可忽略而無需采取補(bǔ)償措施;20%≤|ME|≤50%為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，?|ME|>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，須采取措施補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

比較甲醇-水、乙腈-水及在水相中添加不同體積分?jǐn)?shù)的調(diào)節(jié)劑甲酸（0.02%、0.05%和0.1%）、乙酸銨（2、 5和10 mmol/L）對(duì)9種化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響，結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入微量的甲酸和乙酸銨均可改善峰型，有效提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)值。目標(biāo)化合物的響應(yīng)值隨著甲酸的濃度增大而增大。而當(dāng)乙酸銨的濃度由5 mmol/L提高至10 mmol/L時(shí)，其響應(yīng)值并未明顯增加。將有機(jī)相甲醇換成乙腈后，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰的響應(yīng)值降低。因此，經(jīng)優(yōu)化后最終采用5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和甲醇為流動(dòng)相，在正負(fù)離子模式下，對(duì)9種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/L）分別進(jìn)行全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 9種目標(biāo)化合物均獲得穩(wěn)定的母離子。然后進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能，每種化合物選擇離子豐度最高、基質(zhì)干擾最小的2個(gè)離子對(duì)作為特征離子對(duì)，其中信號(hào)較大的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。在最佳條件下，9種目標(biāo)化合物能夠進(jìn)行定性與定量檢測(cè)，如圖1所示。

2.3分散吸附劑的選擇

以回收率及凈化效果為指標(biāo)，考察50 mg PSA（N-丙基乙二胺）、50 mg C?18、50 mg GCB（石墨化炭）3種分散吸附劑的凈化效果。在添加0.1 mg/kg的目標(biāo)化合物水平下，按照“1.3”方法進(jìn)行提取，提取液分別用以上3種分散吸附劑進(jìn)行凈化，以糙米為例，測(cè)得的回收率見圖2。結(jié)果表明，采用PSA凈化時(shí)，凈化效果較差，基質(zhì)效應(yīng)最大，導(dǎo)致甲拌磷亞砜、硫酮菌唑、氟蟲腈硫醚等農(nóng)藥的回收率均高于120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大;采用GCB凈化時(shí)，GCB對(duì)丙硫菌唑和硫酮菌唑幾乎完全吸附;而采用C?18凈化時(shí)，9種化合物的回收率結(jié)果最優(yōu)（94.6%～111.0%），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～5.9%，基質(zhì)效應(yīng)較小，符合檢測(cè)方法的要求。進(jìn)一步優(yōu)化C?18吸附劑的用量，發(fā)現(xiàn)C?18用量為50 mg時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率最高。綜合考慮，最終選擇50 mg C?18作為凈化吸附劑。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性范圍、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)。

按照“1.6”方法對(duì)空白樣品進(jìn)行處理，然后配制0.005～0.500 mg/L系列空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，其在糙米、面粉、玉米、白菜和蘋果這5種樣品基質(zhì)中檢測(cè)的結(jié)果列于表2。由表2可知，9種化合物在5種基質(zhì)中均表現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中大部分為中等和強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，所以該試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，來降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。5種基質(zhì)中9種化合物在0.005～0.500 mg/L均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.995 9～0.999 9，檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.01～3.46和0.04～8.99 μg/kg。

2.4.2準(zhǔn)確度和精密度。

從表3可看出，在0.01、0.10和?1.00 mg/kg 3個(gè)添加水平下，糙米、面粉、玉米、白菜和蘋果基質(zhì)中9種化合物的平均回收率分別為74.4%～95.1%、73.4%～102.0%、80.2%～105.0%、73.4%～102.0%和71.2%～?102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.86%～16.70%、1.98%～?11.70%、?2.30%～8.95%、2.76%～8.04%和1.28%～15.60%。表明該方法有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，滿足農(nóng)藥殘留分析的?要求。

3結(jié)論與討論

建立同時(shí)檢測(cè)甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物的多殘留檢測(cè)方法，首先是色譜檢測(cè)條件的優(yōu)化。在三重四級(jí)桿串聯(lián)液質(zhì)儀條件下，獲得穩(wěn)定的分析條件需要對(duì)流動(dòng)相配比進(jìn)行優(yōu)化。微量的甲酸（0.1%）和乙酸銨（5 mmol/L）均可明顯改善峰型，并且響應(yīng)值隨著甲酸的濃度增大而增大。有機(jī)相中選擇甲醇比乙腈的響應(yīng)值更高。因此，經(jīng)優(yōu)化后最終采用5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。

9種化合物在5種基質(zhì)中均表現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中大部分為中等和強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，所以該試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，來降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。樣品基質(zhì)中存在不同的雜質(zhì)，用吸附劑進(jìn)行分散固相萃取，是常用的凈化方法。PSA（N-丙基乙二胺）主要是去除糖類和有機(jī)酸等，GCB（石墨化炭）主要用于去除色素，C?18主要用于去除脂類干擾，通過凈化效果比較，選擇C?18作為吸附劑，可以取得良好的凈化效果和滿意的回收率（94.6%～111.0%）。

該研究建立了QuEChERS方法凈化，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，滿足痕量分析要求，適用于糙米、面粉、玉米、白菜和蘋果等農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

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