“紅勛1號(hào)”紅肉蘋(píng)果多酚抗氧化與抗癌活性

齊娜 雷佳蕾 鄧紅 穆韋彤 劉旻昊 孟永宏 郭玉蓉

摘要在前期提取純化紅肉蘋(píng)果多酚及分析組成的基礎(chǔ)上，通過(guò)3項(xiàng)抗氧化試驗(yàn)探討多酚抗氧化能力，并用MTT法和熒光染色法研究多酚的抗癌活性。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為0.80 mg/mL紅肉蘋(píng)果多酚的總還原力與VC持平，0.60 mg/mL的多酚對(duì)ABTS+具有良好的清除作用（清除率94.11%），且對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用。MTT試驗(yàn)顯示紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)3種癌細(xì)胞（HepG2、Hela、A549）的增殖均有明顯抑制作用（IC?50值分別為0.687、0.405、0.635 mg/mL），且對(duì)Hela癌細(xì)胞的抑制率最高達(dá)65.19%;臺(tái)盼藍(lán)染色、AO/EB及DAPI熒光染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多酚濃度增大Hela細(xì)胞凋亡明顯，且細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低，活性氧水平升高，呈劑量依賴性。紅肉蘋(píng)果多酚具有良好的抗氧化活性，可顯著誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡，可作為天然抗氧化、抗癌食品基料進(jìn)行深入開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)鍵詞“紅勛1號(hào)”紅肉蘋(píng)果;多酚;抗氧化活性;抗癌活性

中圖分類號(hào)TS?201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0167-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.045

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Antioxidation and Anticancer Activity of Polyphenols from Red-flesh Apple of Hongxun No.1

QI Na， LEI Jia-lei， DENG Hong et al

（College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062）

AbstractBased on the extraction， purification and composition analysis of polyphenols from red-flesh apple， the antioxidant capacity of polyphenols from red-flesh apple was examined through three antioxidant test in vitro. The anticancer activity of polyphenols from red-flesh apple was determined by MTT assay and fluorescent staining mehods. The antioxidant test results in vitro showed that the total reducing power of polyphenols from red-flesh apple of 0.80 mg/mL， which was equal to VC， 0.60 mg/mL polyphenols had significant free radical-scavenging effect on the ABTS+ with clearances ratio of 94.11%. The polyphenols of red-flesh apple also had obvious protective effect for the oxidation damage of BSA protein induced by Cu2+/H2O2. The MTT assay experiments showed that the polyphenols had notable inhibitory capabilities on the cancer cells proliferation of Hela， HepG2 and A549 （ IC?50 of 0.405， 0.687 and 0.635 mg/mL， respectively）， and had highest inhibition rate of ?65.19% on Hela cancer cells. Then the apoptosis phenomenon of Hela cells was distincted with the polyphenol concentration increased after Trypan blue， AO-EB and DAPI fluorescence staining and Hela cells apoptosis occurred in a dose-dependent manner， while intracellular mitochondrial membrane potential decreased and reactive oxygen species levels increased. The polyphenols from red-flesh apple displayed good antioxidant activity and could significantly induce the apoptosis of Hela cells， it will be used as an anti-cancer or/and natural anti-oxidation material in food industry for further development and utilization.

Key wordsRed-flesh apple of Hongxun No.1;Polyphenols;Antioxidation activity;Anticancer activity

我國(guó)是世界上最大的蘋(píng)果栽培生產(chǎn)國(guó)，有豐富的蘋(píng)果資源[1-2]，其中的新疆野蘋(píng)果作為現(xiàn)代栽培蘋(píng)果（Malus domestica Borkh.）的祖先種遺傳多樣性豐富、種質(zhì)利用潛力大。紅肉蘋(píng)果（Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf）是新疆野蘋(píng)果[3]中的一種珍貴資源，果實(shí)外觀獨(dú)特，生物活性物質(zhì)豐富，鮮果中多酚、果酸、類黃酮、Ca含量高，具有很好的營(yíng)養(yǎng)保健特性[4]。

目前對(duì)紅肉蘋(píng)果的研究主要有遺傳多樣性[5-6]、類黃酮[7]、花青苷的組分含量[8-9]以及紅色發(fā)育機(jī)理[10]等方面，其中王燕等[9]發(fā)現(xiàn)“紫紅1號(hào)” 紅肉蘋(píng)果抗氧化能力是白肉蘋(píng)果的7倍。劉羽等[4]研究了新疆3種品系紅肉蘋(píng)果果皮和果肉中的糖、酸、揮發(fā)性成分的組成與含量，評(píng)價(jià)其抗氧化能力。齊娜等[11]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助提取新疆“紅勛1號(hào)”紅肉蘋(píng)果多酚（得率2.135 mg/g）的條件。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)新疆紅肉蘋(píng)果的酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化能力，具有非常重要的食用與藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。

人類很多疾病的發(fā)生都與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)多酚可中斷氧化反應(yīng)鏈、清除自由基、淬滅單線態(tài)氧等防止氧化反應(yīng)的發(fā)生，還能調(diào)控致癌過(guò)程中的關(guān)鍵酶等[13-14]。蘋(píng)果是最重要的膳食多酚來(lái)源[15]，但不同品種蘋(píng)果多酚由于結(jié)構(gòu)含量的差異其活性不同。紅肉蘋(píng)果多酚具有極強(qiáng)的抗氧化活性，進(jìn)而推斷其有良好的抗癌活性，但是目前鮮見(jiàn)同時(shí)評(píng)價(jià)紅肉蘋(píng)果多酚抗氧化與抗癌活性的報(bào)道。

該研究在前期對(duì)多酚進(jìn)行提取、純化、組成分析的基礎(chǔ)上，采用3項(xiàng)體外抗氧化試驗(yàn)明確新疆紅肉蘋(píng)果多酚的抗氧化能力;并用MTT法研究該多酚對(duì)3種癌細(xì)胞增殖的抑制效果，用熒光染色法探討多酚對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位和活性氧的影響，為紅肉蘋(píng)果多酚在功能食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

1材料與方法

試驗(yàn)于2017年5—12月在陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

1.1材料

“紅勛1號(hào)”紅肉蘋(píng)果于2016年9月下旬蘋(píng)果成熟季采自新疆塔城，大小均一、成熟度相同、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害，摘后包裝低溫冷鏈運(yùn)輸，貯藏于1303實(shí)驗(yàn)室-18 ℃冰箱，待用。

試驗(yàn)所用的細(xì)胞株（HepG2、Hela、A549）、生化試劑（MTT、DMSO、DAPI）、試劑盒（活性氧檢測(cè)、吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）、JC-1法線粒體膜電位檢測(cè)）均與文獻(xiàn)?[16]相同。

1.2設(shè)備與儀器

SB25-12DTDN超聲波機(jī)、YHLGJ-10真空冷凍干燥機(jī)、Thermo高效液相色譜儀、Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、ESCO生物安全柜、BG-verMINI迷你垂直電泳儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱、DMI3000B/DFC450C Leica倒置熒光顯?微鏡[16-17]。

1.3方法

1.3.1紅肉蘋(píng)果多酚的制備。提取紅肉蘋(píng)果多酚[11]，再純化多酚[16]，分析其組成成分，并冷凍干燥純化后的“紅勛1號(hào)”紅肉蘋(píng)果多酚，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2紅肉蘋(píng)果多酚的抗氧化活性。

1.3.2.1

紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)ABTS+自由基的清除作用。分別以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照，制備多酚與ABTS+混合溶液[16]，測(cè)定吸光值，根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

清除率=[AC-（ A-A0）]/ AC×100%（1）

式中，A為紅肉蘋(píng)果多酚溶液在734 nm的吸光值;AC為陰性對(duì)照組的吸光值;A0為本底的吸光值。

1.3.2.2紅肉蘋(píng)果多酚總還原力的測(cè)定。制備混勻液和測(cè)定吸光值[20]。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，70%的乙醇溶液作為本底對(duì)照，再根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

吸光值=A-A0（2）

式中，A為紅肉蘋(píng)果多酚溶液在734 nm的吸光值;A0為本底的吸光值。

1.3.2.3

紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷的保護(hù)作用。①變性[17];②依次進(jìn)行制膠、上樣、電泳、染色、脫色、圖像分析[18]。

1.3.3紅肉蘋(píng)果多酚的抗癌活性。

1.3.3.1細(xì)胞的培養(yǎng)方法。進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存[18-19]。

1.3.3.2

MTT法測(cè)定紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用。分別培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行MTT試驗(yàn)[18-19]，根據(jù)以下公式計(jì)算出癌細(xì)胞的存活率，存活率= 1-（空白對(duì)照組吸光?值-樣品試驗(yàn)組吸光值）/空白對(duì)照組吸光值×100%。

1.3.3.3

臺(tái)盼藍(lán)染色。進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)[19]，在倒置顯微鏡下觀察各孔內(nèi)細(xì)胞形態(tài)以及染色狀態(tài)，并拍照記錄。

1.3.3.4

AO/EB和DAPI熒光染色。進(jìn)行AO和EB染色、DAPI染色[19]，放于倒置熒光顯微鏡下觀察各孔內(nèi)細(xì)胞的特征，并進(jìn)行拍照保存。

1.3.3.5

Hela細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)的測(cè)定。用新疆紅肉蘋(píng)果多酚處理Hela細(xì)胞后[20]，吸掉培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將處理好的樣品立即放置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3.3.6

Hela細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的測(cè)定。用新疆紅肉蘋(píng)果多酚處理Hela細(xì)胞后[20]，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，同樣將處理好的樣品立即放置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法采用Design-Expert10.0及DPS軟件處理數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1紅肉蘋(píng)果多酚的抗氧化活性

新疆紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)ABTS+自由基的清除作用如圖1a所示，新疆紅肉蘋(píng)果多酚總還原力如圖1b所示，新疆紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷的保護(hù)作用如圖1c所示。

從圖1a可以看出，VC和新疆紅肉蘋(píng)果多酚均對(duì)ABTS+自由基具有很強(qiáng)的清除作用，并且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性;當(dāng)濃度達(dá)0.60 mg/mL時(shí)，多酚的清除率達(dá)94.11%（VC的清除率為93.30%），二者的清除能力基本相同。從圖1b可以發(fā)現(xiàn)，VC和新疆紅肉蘋(píng)果多酚的還原能力都比較強(qiáng)，且有顯著的劑量依賴性;當(dāng)溶液濃度達(dá)0.80 mg/mL時(shí)，還原力逐漸趨于穩(wěn)定，VC與紅肉蘋(píng)果多酚二者的還原力基本相同。

在生物體中·OH的量高于正常水平時(shí)，便會(huì)對(duì)生物大分子產(chǎn)生攻擊，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化損傷。而新疆紅肉蘋(píng)果多酚可對(duì)氧化損傷起到保護(hù)作用;作用越強(qiáng)，電泳條帶顏色越深，則灰度值越大。從圖1c可以看出，加入新疆紅肉蘋(píng)果多酚的電泳條帶的灰度值均高于陰性對(duì)照（0 mg/mL），并且呈劑量依賴性，逐漸增大。當(dāng)多酚濃度達(dá)3.2 mg/mL時(shí)，電泳條帶灰度值高于空白組。該結(jié)果表明，新疆紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，且表現(xiàn)出劑量依賴性。

2.2紅肉蘋(píng)果多酚的抗癌活性

2.2.1紅肉蘋(píng)果多酚的抗癌效果。

2.2.1.1

MTT試驗(yàn)結(jié)果。從圖2a可以看出，新疆紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)3種癌細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制作用，并呈時(shí)間和濃度的依賴性，但是作用效果不同。多酚作用于3種癌細(xì)胞的IC?50值分別為0.405、0.687和0.635 mg/mL，對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果最為明顯（細(xì)胞活力僅34.81%，抑制率65.19%）。由圖2b可知，新疆紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)Hela細(xì)胞作用6、12和?24 h時(shí)，均具有明顯的抑制作用，且不同時(shí)間下IC?50值分別為0.635、0.405和0.360 mg/mL。根據(jù)抑制效果和時(shí)間經(jīng)濟(jì)，選擇12 h為處理時(shí)間。

2.2.1.2

細(xì)胞染色試驗(yàn)結(jié)果。①臺(tái)盼藍(lán)染色。臺(tái)盼藍(lán)染色可快速區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞[21]。紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響如圖3a所示，與無(wú)處理對(duì)照組（0 mg/mL）相比，紅肉蘋(píng)果多酚作用濃度為0.1 mg/mL時(shí)，可以觀察出已經(jīng)有部分Hela細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生明顯的變化（皺縮、變小變圓、間隙逐漸增大），有少量細(xì)胞被染成藍(lán)色;隨著多酚濃度增加達(dá)?0.5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞大部分發(fā)生皺縮凋亡現(xiàn)象，被染成藍(lán)色，基本失去原來(lái)的形態(tài)，且呈劑量依賴性。②熒光染色。吖啶橙（AO）在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光;溴化乙錠（EB）僅能與受損的細(xì)胞結(jié)合，在激發(fā)光下發(fā)出橘紅色熒光[22]。如圖3b所示，將不同濃度的新疆紅肉蘋(píng)果多酚作用于Hela細(xì)胞12 h后，對(duì)照組（0 mg/mL）Hela正常活細(xì)胞呈現(xiàn)均勻綠色熒光，多酚作用濃度為0.1 mg/mL時(shí)，Hela細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生明顯固縮，細(xì)胞有逐漸變紅的趨勢(shì)（早期凋亡細(xì)胞），個(gè)別細(xì)胞完全呈橘紅色（晚期凋亡細(xì)胞）;隨著多酚濃度的增大，被染成橘紅色細(xì)胞的數(shù)量也增多。DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）熒光染色結(jié)果如圖3c所示，對(duì)照組（0 mg/mL）中的Hela細(xì)胞內(nèi)部熒光染色均勻，當(dāng)新疆紅肉蘋(píng)果多酚作用濃度為?0.1 mg/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亮斑（細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生凋亡），當(dāng)多酚濃度增加時(shí)，細(xì)胞亮斑的數(shù)量越來(lái)越多，凋亡現(xiàn)象也越來(lái)越明顯。這些顯著特征可以證明新疆紅肉蘋(píng)果多酚可有效誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，并與其劑量呈正相關(guān)。

2.2.2紅肉蘋(píng)果多酚的抗癌機(jī)制。

2.2.2.1

紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響。線粒體膜電位是一種反映細(xì)胞受損效應(yīng)較靈敏的指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體功能發(fā)生紊亂，膜電位便發(fā)生變化[23]。采用JC-1熒光探針[24]測(cè)定細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化（圖4），與對(duì)照組（橘紅色熒光，膜電位高）相比，紅肉蘋(píng)果多酚可以明顯增強(qiáng)Hela細(xì)胞內(nèi)綠色的熒光，當(dāng)濃度達(dá)0.5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)幾乎完全呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明膜電位低，而線粒體膜電位的下降是細(xì)胞早期凋亡的重要現(xiàn)象;細(xì)胞凋亡時(shí)由于線粒體膜巨型通道PT孔開(kāi)啟，使得線粒體膜的通透性增大，膜兩側(cè)的離子重新分布，造成線粒體膜電位的迅速下降，所以線粒體膜電位的降低與細(xì)胞凋亡水平有密切關(guān)系。圖4顯示紅肉蘋(píng)果多酚可導(dǎo)致Hela細(xì)胞線粒體損傷和功能障礙，可顯著降低線粒體膜電位，且呈劑量依賴性。

2.2.2.2

紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)活性氧生成的影響?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是一種活潑的含氧化合物，過(guò)量的ROS可以激活細(xì)胞發(fā)生凋亡，可選擇藥物誘導(dǎo)細(xì)胞中ROS發(fā)生變化以抑制腫瘤細(xì)胞[25]。采用DCFH-DA熒光探針?lè)y(cè)定了不同濃度的新疆紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響（圖5）。DCFH-DA（無(wú)熒光）能夠穿過(guò)細(xì)胞膜被水解成DCFH，在細(xì)胞氧化劑作用下DCFH生成具有熒光的DCF，可根據(jù)熒光強(qiáng)度來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平的高低。如圖5所示，和對(duì)照組（0 mg/mL）相比，紅肉蘋(píng)果多酚（0.5 mg/mL）處理過(guò)的Hela細(xì)胞的熒光顯著增強(qiáng)，且呈劑量相關(guān)性，說(shuō)明紅肉蘋(píng)果多酚能刺激Hela細(xì)胞產(chǎn)生ROS，可能會(huì)減弱Hela細(xì)胞線粒體抗氧化防御機(jī)制，使線粒體活性氧產(chǎn)生增多，這與線粒體膜電位降低一致。

3結(jié)論

“紅勛1號(hào)”紅肉蘋(píng)果多酚對(duì)ABTS+自由基的清除作用與VC相當(dāng)，同時(shí)該多酚具有較高的總還原力，對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷具有良好的保護(hù)作用。此外，紅肉蘋(píng)果多酚能夠有效抑制3種癌細(xì)胞（Hela、A549、HepG2）的增殖，且呈劑量依賴性;對(duì)Hela細(xì)胞抑制最為明顯（IC?50值為?0.405 mg/mL）。臺(tái)盼藍(lán)染色、AO/EB及DAPI熒光染色發(fā)現(xiàn)紅肉蘋(píng)果多酚處理后的Hela細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，因?yàn)樵摱喾幽軌蚪档虷ela細(xì)胞線粒體膜電位，改變線粒體通透性，進(jìn)而使細(xì)胞功能受損，發(fā)生凋亡，同時(shí)刺激Hela細(xì)胞中ROS的生成，發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。

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