辣木離體再生體系的建立

陳麗文 時(shí)群 陳乃明 何貴整 吳紅英

摘要以辣木種子為外植體，誘導(dǎo)獲得無(wú)菌苗，然后通過用無(wú)菌苗的嫩莖誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽，再將不定芽誘導(dǎo)生根，獲得完整植株，建立辣木的離體再生體系。結(jié)果表明，適合辣木種子誘導(dǎo)無(wú)菌苗的培養(yǎng)基為 MS0，誘導(dǎo)率達(dá)95%;適合無(wú)菌苗莖段誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+2，4-D 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)87.03%;適合愈傷組織分化不定芽及不定芽增殖的培養(yǎng)基為改良MS+6-BA?0.6 mg/L+IAA 0.2 mg/L，芽分化率達(dá)83.33%，芽增殖系數(shù)達(dá)4.2;適合不定芽生根的培養(yǎng)基為 1/3MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L，生根率達(dá)92.7%，平均根數(shù)達(dá)5.78。

關(guān)鍵詞辣木;離體培養(yǎng);再生體系

中圖分類號(hào)S?792.99文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0121-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.032

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Establishment of Regeneration System in vitro for Moringa oleifera Lam

CHEN Li-wen，SHI Qun，CHEN Nai-ming et al（Qinzhou Forestry Science Research Institute，Qinzhou，Guangxi 535099）

AbstractThe seeds of Moringa oleifera were used as explants to induce and obtain aseptic seedlings， and then the callus was induced to differentiate adventitious buds by using the tender stems of seedlings，then the adventitious buds were induced to take root to obtain complete plants and establish in vitro regeneration system.Results showed that culture medium MS0 was suitable for the seeds of M. oleifera to induce sterile seedings，the induction rate was 95%.The optimal callus induced medium was MS+2，4-D 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，the induction rate was 87.03%.The optimal medium for adventitious buds differentiation and multiplication were modified MS+6-BA0.6?mg/L+IAA0.2?mg/L，the differentiation rate was 83.33%，the muitiplication coefficient was 4.2.The optimal rooting culture medium was 1/3MS+IBA0.5?mg/L+NAA?0.2?mg/L，the rooting rate was 92.7%，the average root number was 5.78.

Key wordsMoringa oleifera;in vitro culture;Regeneration system

辣木（Moringa oleifera Lam.）為辣木科辣木屬植物，又稱鼓槌樹，是一種有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶植物，原產(chǎn)于印度北部[1]。辣木是目前已發(fā)現(xiàn)的最好植物蛋白、維生素A、葉酸、泛酸、鈣、鐵、硒等多種營(yíng)養(yǎng)素的來(lái)源，其葉、果均有優(yōu)良的食用和藥用價(jià)值，果實(shí)提取的植物油具有獨(dú)特的工業(yè)用途，是全球最熱門的高營(yíng)養(yǎng)多用途植物，在很多國(guó)家都作為重要藥食和工業(yè)原料來(lái)利用，被譽(yù)為“植物中的鉆石”[2-5]。

目前，辣木主要的育苗方式是播種繁殖和扦插，不僅育苗周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低，會(huì)造成品種退化，而且易受季節(jié)氣候條件的限制[6]。通過離體快繁建立植株再生體系是解決辣木種苗繁殖的一種有效途徑，為辣木良種苗木的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料選用辣木改良種PKM1的種子作為外植體材料，種子采自云南。

1.2方法

1.2.1無(wú)菌苗誘導(dǎo)。

選取顆粒飽滿的良種辣木種子，剝?nèi)ネ夥N殼，將種仁在超凈工作臺(tái)上以0.1%HgCl2溶液消毒?10 min，再用無(wú)菌水沖洗5遍，瀝干水后接種到初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)室用黑布遮蓋進(jìn)行暗培養(yǎng)，待種子開始萌動(dòng)，長(zhǎng)出白色根，再掀開黑布繼續(xù)培養(yǎng)直至長(zhǎng)成無(wú)菌小苗。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)。

將獲得的無(wú)菌苗剪切成約1 cm小段，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接入3個(gè)小段，每種培養(yǎng)基接種15瓶，接種時(shí)使切口與培養(yǎng)基相接觸，接種后放置在培養(yǎng)室用黑布遮蓋進(jìn)行暗培養(yǎng)15 d，待愈傷組織形成后移到自然光條件下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率。

1.2.3不定芽誘導(dǎo)與增殖。

將長(zhǎng)出的愈傷組織切下接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)基接種2個(gè)愈傷組織塊，每種培養(yǎng)基接種15瓶，接種后放在培養(yǎng)室用黑布遮蓋進(jìn)行暗培養(yǎng)10 d，待不定芽萌出后移到自然光條件下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率，然后每隔30 d將不定芽轉(zhuǎn)接到適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

1.2.4生根誘導(dǎo)。

剪取生長(zhǎng)健壯的不定芽接種至生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種10株小芽，每種培養(yǎng)基接種15瓶，接種后放在培養(yǎng)室內(nèi)弱光條件下培養(yǎng)，待小苗的基部切口處長(zhǎng)出根系后移到煉苗棚進(jìn)行煉苗，煉苗15 d左右就可以進(jìn)行生根苗的移栽。

1.2.5培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

1.2.5.1培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，根據(jù)不同培養(yǎng)階段的需要添加不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、防褐化劑、其他添加物等。培養(yǎng)基pH為5.8，誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基每升添加3.8 g瓊脂粉、30 g白砂糖，生根培養(yǎng)基每升添加4.2 g瓊脂粉、20 g白砂糖。培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌鍋滅菌20 min。培養(yǎng)基取出后自然冷卻，待其凝固后即可使用。

1.2.5.2培養(yǎng)條件。

培養(yǎng)室溫度保持在（25±2）℃，空氣濕度為75%～85%，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，每天光照時(shí)間為12 h。

1.2.6數(shù)據(jù)處理。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和LSD多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1無(wú)菌苗誘導(dǎo)情況

通過辣木種子誘導(dǎo)獲取無(wú)菌苗比較容易，將經(jīng)過消毒處理的辣木種仁接種到初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS0（不加任何激素和添加物）中，暗培養(yǎng)7 d后種子開始萌動(dòng)，長(zhǎng)出長(zhǎng)約1 cm的白色根，然后掀開黑布繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d即可長(zhǎng)出小苗，15～20 d無(wú)菌苗可長(zhǎng)至3～4 cm，無(wú)菌苗的誘導(dǎo)率達(dá)95%。

2.2不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)辣木無(wú)菌苗莖段誘導(dǎo)愈傷組織的影響

將辣木無(wú)菌苗剪切成小段，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d左右，莖段兩端慢慢翹起，莖段彎曲，莖段兩端切口部位開始出現(xiàn)少量愈傷組織，大約20 d，大部分莖段切口處形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)情況見表1。

從表1可以看出，A4處理的無(wú)菌苗莖段愈傷組織的誘導(dǎo)率最高。統(tǒng)計(jì)分析表明，A4處理與其他處理均存在顯著差異。根據(jù)觀察結(jié)果可知，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率也增高，但濃度過高容易導(dǎo)致愈傷組織表面出現(xiàn)老化現(xiàn)象。綜合比較看出，A4培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，愈傷組織生長(zhǎng)也較好，愈傷組織質(zhì)地致密，黃綠色。MS+2，4-D0.8 mg/L+?KT0.3 mg/L為適合愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)?87.03%，誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)狀況最好。

2.3不同無(wú)機(jī)鹽濃度及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)辣木不定芽分化及增殖的影響

將無(wú)菌苗莖段切口長(zhǎng)出的愈傷組織切下接種到芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25 d左右愈傷組織塊上分化出不定芽，待芽高長(zhǎng)到約3 cm時(shí)，將芽叢切下，接種至同樣的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。辣木不定芽分化及增殖情況見表2，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3、4。

從表3可以看出，不同無(wú)機(jī)鹽濃度的基本培養(yǎng)基對(duì)辣木不定芽分化及增殖的影響存在顯著差異，其中改良MS培養(yǎng)基的平均芽分化率和平均芽增殖系數(shù)更高，分別為63.33%和3.18;而且，以MS為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的不定芽長(zhǎng)出的葉片顏色偏黃，有掉葉的現(xiàn)象，而采用經(jīng)過改良的MS作為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)的不定芽則比較健壯，長(zhǎng)出的葉片顏色翠綠，這可能是由于改良MS培養(yǎng)基中適當(dāng)提高了KH2PO4和鐵鹽的濃度，在培養(yǎng)基中提高磷酸根離子水平可抵消IAA對(duì)芽分化的抑制作用，增加芽的增殖率[7];而鐵鹽是培養(yǎng)基中用量較多的一種無(wú)機(jī)鹽類物質(zhì)，對(duì)植物組織葉綠素的合成和延長(zhǎng)生長(zhǎng)起到重要的作用[8]。

從表4可以看出，同樣濃度的6-BA分別與NAA、IAA組合的培養(yǎng)基對(duì)辣木愈傷組織分化芽及芽的增殖效果不同，兩者之間存在極顯著差異，添加IAA的培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)芽的分化率、增殖系數(shù)更高，芽生長(zhǎng)也較好;此外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在同樣濃度的生長(zhǎng)素組合下，隨著6-BA濃度的提高，不定芽會(huì)出現(xiàn)玻璃化、葉片卷曲的現(xiàn)象，因此，6-BA0.6 mg/L+IAA0.2 mg/L為更好的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合配比。

經(jīng)綜合比較，改良MS+6-BA0.6 mg/L+IAA0.2 mg/L培養(yǎng)基比較適合辣木不定芽的分化和增殖，芽分化率達(dá)?83.33%、芽增殖系數(shù)達(dá)4.2，且芽生長(zhǎng)健壯，葉片舒展、葉色?翠綠。

2.4不同無(wú)機(jī)鹽濃度及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)辣木不定芽生根的影響

剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)約3 cm的不定芽接種至生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，放在培養(yǎng)室內(nèi)弱光條件下培養(yǎng)，15 d后小苗的基部切口處開始長(zhǎng)根。辣木不定芽生根情況見表5，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表6、7。

從表6可以看出，不同無(wú)機(jī)鹽濃度的基本培養(yǎng)基對(duì)辣木不定芽生根的影響存在顯著差異，不同無(wú)機(jī)鹽濃度的基本培養(yǎng)基的生根效果為1/3MS>1/2MS>MS，可以看出辣木不定芽生根誘導(dǎo)需要較低的無(wú)機(jī)鹽濃度，以無(wú)機(jī)鹽濃度為1/3MS時(shí)的平均生根率和平均根數(shù)最高，分別為81.13%和4.36。所以，辣木不定芽生根選用1/3MS為基本培養(yǎng)基比較合適。

從表7可以看出，添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IBA、NAA及兩者組合的生根培養(yǎng)基對(duì)辣木不定芽生根的效果不同，其中以IBA和NAA組合的生根效果好，并與單獨(dú)添加IBA或NAA的生根效果存在極顯著差異。單獨(dú)添加同濃度的IBA或NAA的生根培養(yǎng)基的辣木不定芽生根率和平均根數(shù)差異不顯著，但從表5看，單獨(dú)添加IBA的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)的小苗根系較細(xì)長(zhǎng)、側(cè)根較少，單獨(dú)添加NAA的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)的小苗根系較粗短、側(cè)根較多，而添加IBA與NAA組合的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)的小苗根系粗壯、須根發(fā)達(dá)。因此，IBA?0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L為適宜辣木不定芽生根的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合。

經(jīng)綜合比較，1/3MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基比較適合辣木不定芽生根，生根率達(dá)92.7%，平均根數(shù)達(dá)?5.78，且根系粗壯、須根發(fā)達(dá)。

3討論

（1）外植體材料的選擇常常是組織培養(yǎng)獲得成功與否的關(guān)鍵。從理論上講，植物的任何組織或器官都能作為組織培養(yǎng)的外植體，但由于植物種類、生長(zhǎng)階段、生理狀態(tài)、年齡、生長(zhǎng)部位等不同，其無(wú)性繁殖能力也不一樣，同一植物不同的組織和器官其再生能力也有差異[9]。該試驗(yàn)采用辣木種子作為外植體，誘導(dǎo)獲得無(wú)菌苗，再用無(wú)菌苗的莖段誘導(dǎo)愈傷組織，通過愈傷組織分化不定芽，最終形成完整植株。通過種子雖然能較快地獲得無(wú)菌材料，但須經(jīng)過愈傷組織的途徑才分化獲得不定芽，過程相對(duì)較長(zhǎng)。今后可嘗試以辣木苗嫩枝作為外植體，直接誘導(dǎo)獲得無(wú)菌芽進(jìn)行繁殖，為辣木離體再生體系的建立提供更多的途徑。

（2）辣木對(duì)細(xì)胞分裂素特別敏感，在離體培養(yǎng)過程中極易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。玻璃化是在芽分化啟動(dòng)后的生長(zhǎng)過程，

由碳水化合物、氮代謝和水分狀態(tài)等發(fā)生生理性異常所引起，它受多種因素影響和控制，主要有溫度、光照、激素種類和濃度、瓊脂用量、酸堿度、糖濃度、碳氮比、乙烯等[10]。該試驗(yàn)通過調(diào)節(jié)光照、激素濃度可以大大減少玻璃化苗的產(chǎn)生。

（3）在辣木離體培養(yǎng)過程中，無(wú)論是增殖培養(yǎng)還是生根培養(yǎng)，均很容易出現(xiàn)葉子黃化脫落的現(xiàn)象。該試驗(yàn)通過提高鐵鹽的濃度，并調(diào)節(jié)瓊脂和蔗糖的用量可減少葉子黃化?脫落。

（4）在辣木不定芽生根培養(yǎng)時(shí)，將培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度降低，可提高生根率，這種無(wú)機(jī)鹽濃度降低的功能雖不是十分明確，但培養(yǎng)基中的鹽濃度會(huì)影響到其滲透壓，從而影響到植物離體培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)吸收和向培養(yǎng)基中釋放一些物質(zhì)，促進(jìn)植物生根。

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