麥洼牦牛PRL基因多態(tài)與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析

李鑄 何世明 吳錦波 艾鷖 蹇尚林 劉建 雍軍

摘要研究旨在了解麥洼牦牛催乳素（PRL）基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP），探究與牦牛產(chǎn)奶性能相關(guān)的分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序篩選麥洼牦牛PRL基因的SNP位點(diǎn)，運(yùn)用DNAMAN和SPSS等軟件對(duì)PRL基因型與產(chǎn)奶性狀進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，位于PRL基因996 bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)疑似SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)T堿基缺失突變;對(duì)比麥洼牦牛不同PRL基因型的產(chǎn)奶性狀，突變型個(gè)體的?153 d產(chǎn)奶量、乳蛋白質(zhì)率、乳糖率和乳中的體細(xì)胞數(shù)均下降（ P>0.05），而乳脂率則顯著升高（P<0.05），暗示該處堿基T堿基缺失對(duì)乳中脂肪含量有顯著影響。

關(guān)鍵詞牦牛;PRL基因;SNPs;產(chǎn)奶性狀;關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)S?823.8+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0108-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.028

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Correlation Analysis on Polymprphism of Prolactin Gene with Milk Performance Traits in Maiwa Yak

LI Zhu，HE Shi-ming，WU Jin-bo et al（Institute of Animal Science and Technology of Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture， Hongyuan，Sichuan 624402）

AbstractIn order to study the single nucleotide polymorphism （SNP） of the Maiwa yak prolactin gene and to explore the molecular markers related to milk performance traits of yak. We used the direct PCR sequencing method to screen the SNPs， and analyzed the correlation between prolactin genotype and milk performance traits by employing statistical softwares such as DNAMAN and SPSS.The results showed that we found one SNP site which located at 996 bp of prolactin gene and its T-base deletion mutation at this site. By comparing the milk performance traits of different prolactin gene types， the 153 d milk yield， lactoprotein， milk sugar and somatic cell number in milk of mutant individuals were lower than normal genotype individuals （P>0.05）， while the milk fat increased significantly （P<0.05）. It was suggested that the absence of T-base had a significant effect on the fat content of Maiwa yak milk.

Key wordsMaiwa yak;Prolactin gene;Single nucleotide polymorphism;Milk performance traits;Correlation analysis

麥洼牦牛屬于草地型牦牛，主產(chǎn)于位于川、甘、青3省結(jié)合部的四川省紅原縣麥洼、瓦切鄉(xiāng)和若爾蓋縣包座鄉(xiāng)等地區(qū)，中心產(chǎn)區(qū)在紅原縣麥洼地區(qū)，在周邊的黑水縣、阿壩縣、壤塘縣、九寨溝縣和松潘縣等地區(qū)也有分布[1]。麥洼牦牛是青藏高原的地方優(yōu)良品種， 具備乳、肉兼用的種質(zhì)特性， 已被列入《中國(guó)牛品種志》和《四川家畜家禽品種志》[2]。我國(guó)現(xiàn)有飼養(yǎng)量約170萬(wàn)頭，占全國(guó)牦?？倲?shù)的11%，具有適應(yīng)性好、產(chǎn)乳性好、乳脂率高和馱力大等優(yōu)點(diǎn)，不僅是我國(guó)著名奶肉兼用型地方優(yōu)良品種，還是牦牛遺傳資源寶庫(kù)中珍貴的種質(zhì)資源和基因庫(kù)[3]。

催乳素（prolactin， PRL）是由199個(gè)氨基酸殘基組成的一種蛋白質(zhì)，由腺垂體分泌，其主要功能是促進(jìn)乳腺發(fā)育，引起和維持泌乳。牦牛PRL基因全長(zhǎng)為9 647 bp，可轉(zhuǎn)錄出X1、X2和X3三型催乳素，其中X1型和X2型催乳素基因均由5個(gè)外顯子組成，而X3型催乳素基因由4個(gè)外顯子組成。PRL通過(guò)與靶細(xì)胞膜表面的催乳素受體結(jié)合，啟動(dòng)JAK2/STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終激活反式作用因子STAT5，使其作用于乳蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的靶序列，啟動(dòng)或增強(qiáng)以乳蛋白基因啟動(dòng)子為作用元件的靶基因的表達(dá)[4]。此外，PRL基因還在個(gè)體生殖生理調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、免疫活動(dòng)及滲透壓調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳遞等方面具有一定的作用，被認(rèn)為是對(duì)奶牛泌乳性能具有重要作用的候選基因。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，催乳素基因?qū)Σ溉閯?dòng)物的乳腺發(fā)育和泌乳具有影響作用，尤其是與產(chǎn)奶量和乳成分呈正相關(guān)，因此成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。例如，在PRL基因全序列克隆方面，有學(xué)者采用Long PCR等方法克隆得到全長(zhǎng)?9 388 bp的牛催乳素基因組序列[5]，而后利用亞克隆的方法構(gòu)建該基因組的pcDNA3.1（+）/ bPRL重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，結(jié)果通過(guò)RT-PCR成功擴(kuò)增到了預(yù)期目的片段，證實(shí)了該基因組DNA在轉(zhuǎn)錄水平上的生物學(xué)功能[6];有學(xué)者以PRL基因外顯子為研究對(duì)象，分別對(duì)第2[7]、第3[8]和第4[9]這3個(gè)外顯子的群體遺傳特征進(jìn)行了相應(yīng)分析。而對(duì)于牛PRL基因與泌乳性狀之間的相關(guān)性，學(xué)者們也進(jìn)行了大量的研究，有學(xué)者綜述了PRL的結(jié)構(gòu)與功能、基因定位及作用機(jī)制、PRL上的SNPs與產(chǎn)奶性狀關(guān)系等幾個(gè)方面的內(nèi)容[10];有學(xué)者采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)分析了荷斯坦奶牛催乳素基因的多態(tài)性，結(jié)果檢測(cè)到AA、AB、BB這3種基因型[11];國(guó)外學(xué)者如Mehmannavaz等[12]、Alfonso等[13]研究也證實(shí)PRL基因與產(chǎn)奶性狀之間具有很大相關(guān)性。

目前已有對(duì)麥洼牦牛基因SNPs的部分研究，但對(duì)PRL基因單核苷酸多態(tài)性的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，阿壩州畜牧科學(xué)技術(shù)研究所與西南民族大學(xué)、四川省草原科學(xué)研究院、阿壩州畜牧工作站等單位合作，在紅原縣開(kāi)展麥洼牦牛高產(chǎn)奶新品系選育工作。筆者以PCR法和測(cè)序法研究牦牛催乳素基因單核苷酸多態(tài)性，探討與牦牛產(chǎn)奶性狀之間的相關(guān)性，旨在為麥洼牦牛高產(chǎn)奶品系選育工作提供參考和為進(jìn)一步確定催乳素基因功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

于阿壩州紅原縣瑪莎村、熱多村和澤木科3個(gè)區(qū)域隨機(jī)抽取活潑健康、體形正常的2～4胎次母牦牛49頭，并記錄其耳號(hào)。于2017年6—10 月清晨牧民擠奶時(shí)測(cè)定日擠奶量，每10 d測(cè)定一次，指標(biāo)測(cè)定和記錄均分別由專人進(jìn)行。擠奶量測(cè)定期間同時(shí)采用無(wú)菌注射器采集麥洼牦牛血樣，共取得血樣49份，盛裝于無(wú)菌15 mL離心管中。血樣現(xiàn)場(chǎng)暫存于冰盒中，后保存于-60?℃超低溫冰箱中待用。

1.2主要試劑

血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit，50preps離心柱型）產(chǎn)自天根生化科技（北京）有限公司;PCR反應(yīng)體系配制使用的2×Taq PCR Mastermix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;Trizma base， Brotic acid和EDTA等試劑均產(chǎn)自VETEC公司;核酸染料Goldview 購(gòu)自博奧拓達(dá)科技（北京）有限公司。

1.3DNA提取和檢測(cè)

采用血液基因組DNA提取試劑盒提取麥洼牦牛血樣DNA。血樣于-60 ℃冰箱中取出后放置于水中解凍，再按照DNA提取試劑盒中提供的說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，提取DNA產(chǎn)物放置于-20 ℃冰箱中備用。制備1%瓊脂糖凝膠，用移液槍吸取1 μL的6×Loading buffer，與?4 μL DNA產(chǎn)物在PE手套上混勻，再吸取混勻后的液體加入瓊脂糖凝膠板上的點(diǎn)樣孔內(nèi)，旁邊點(diǎn)上Marker DNA 4 μL，?121 V條件下電泳40 min，再通過(guò)照膠儀于紫外光下檢測(cè)DNA純度，對(duì)有雜帶或純度不高的樣品重新提取血液DNA并進(jìn)行檢測(cè)。

1.4引物合成和PCR擴(kuò)增

參考文獻(xiàn)[9]中對(duì)水牛PRL基因多態(tài)性的研究，設(shè)計(jì)一對(duì)引物序列用于樣品中PRL基因的擴(kuò)增，引物序列為F：5-AAGCCTTTTACATTATTTCAACCC-3，R：5-AATTCTCTGACCTCA AGCCACTCT-3，引物由上海英濰捷基公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 103 bp。

PCR反應(yīng)體系25 μL：包括DNA模板1 μL，上下游Primer各1 μL，2×Taq PCR Mastermix（含染料）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min;4 ℃保存。制備1%瓊脂糖凝膠，PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物電泳40 min后，于紫外燈下觀察其擴(kuò)增結(jié)果。合格PCR產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱中，以待測(cè)序。

1.5SNP篩選和序列分析

按照測(cè)序要求準(zhǔn)備PCR產(chǎn)物及引物，直接寄送英濰捷基貿(mào)易有限公司（廣州實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序返回的正反向序列，運(yùn)用DNAMAN 5.0對(duì)擴(kuò)增序列的測(cè)序結(jié)果與NCBI上參考目的片段序列進(jìn)行比對(duì)并校正拼接;使用Chromas軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，篩選獲得SNPs位點(diǎn)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用DNAMAN5.0對(duì)序列進(jìn)行校正和比對(duì)分析，測(cè)序峰圖采用Chromas軟件進(jìn)行分析，利用SPSS 21.0軟件比較樣本類群間2種基因型和產(chǎn)奶量之間的關(guān)聯(lián)性，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性?差異）。

2結(jié)果與分析

2.1麥洼牦?；蚪MDNA提取與檢測(cè)

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的麥洼牦牛血液基因組DNA進(jìn)行純度檢測(cè)，濃度均在100 ng/μL以上，DNA樣品測(cè)定的OD?260/OD?280比值均在1.6～1.8，符合要求。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），在紫外燈照射下基因組DNA條帶明亮單一，表明所提DNA樣品濃度質(zhì)量好，可以用于展開(kāi)后續(xù)的PCR試驗(yàn)。

2.2牦牛PRL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

根據(jù)設(shè)計(jì)引物對(duì)麥洼牦牛PRL基因的5側(cè)翼調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出的麥洼牦牛PRL基因序列長(zhǎng)度為1 103 bp，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外燈照射下結(jié)果均和目的片段大小相一致，條帶單一且清晰（圖2），可用于測(cè)序分析。

2.3牦牛PRL基因SNPs的篩查和檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后進(jìn)行正反雙向測(cè)序，均由測(cè)序公司完成。采用DNAMAN 5.0軟件拼接原始序列，并對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，共篩查到1個(gè)疑似SNP位點(diǎn)，位于目標(biāo)基因序列的998 bp處，正常序列為5-ATGAAATG-3，突變序列為5-A_GAAATG-3，該處堿基T缺失。進(jìn)一步比對(duì)全部樣本的測(cè)序結(jié)果，共計(jì)29個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)處T堿基缺失，初步確定為SNP位點(diǎn)。

2.4PRL基因多態(tài)性與牦牛泌乳性狀的相關(guān)性

將所有樣本按照突變型（T堿基缺失）和正常型分為2組，對(duì)2種基因型下牦牛153 d產(chǎn)奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖和體細(xì)胞數(shù)等進(jìn)行相關(guān)分析。表1顯示了PRL基因不同基因型對(duì)麥洼牦牛產(chǎn)奶性狀的影響。從表1可以看出，經(jīng)檢驗(yàn)分析，2種基因型下牦牛產(chǎn)奶性狀存在一些差異，部分指標(biāo)差異顯著（P0.05），特別的，乳脂率在PRL基因998 bp處T堿基缺失后顯著升高了（P<0.05），暗示該處T堿基缺失對(duì)乳中脂肪含量有顯著影響。

3討論

PRL基因與乳脂等泌乳性狀極度相關(guān)，也是奶牛產(chǎn)奶性狀的主要候選基因，但目前對(duì)牦牛催乳素基因SNPs的研究還較少。該研究于阿壩州紅原縣搜集了49個(gè)麥洼牦牛的血液樣本，并提取DNA和設(shè)計(jì)引物，再通過(guò)直接測(cè)序法篩選PRL基因的疑似突變位點(diǎn)，以期找出與麥洼牦牛泌乳性狀相關(guān)的SNPs。對(duì)測(cè)序結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)有29個(gè)樣本于PRL基因996 bp處T堿基突變?nèi)笔?，且該位點(diǎn)突變對(duì)牦牛產(chǎn)奶性狀有顯著影響，但目前該種基因型的個(gè)體數(shù)量較少，因此在后續(xù)的研究中有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本群體來(lái)加以驗(yàn)證。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，這種T堿基突變型對(duì)乳脂的含量有顯著影響，因此有可能作為影響麥洼牦牛產(chǎn)奶性狀的一個(gè)重要候選基因型進(jìn)行分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)而應(yīng)用到麥洼牦牛高產(chǎn)奶群的選育工作中。

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