豬細(xì)小病毒NJ株ST細(xì)胞適應(yīng)性研究

唐波 劉國陽 常晨 華濤 張道華

摘要為評價ST細(xì)胞代次的增高對豬細(xì)小病毒NJ株免疫原性的影響，將第10、30、60代ST細(xì)胞分別接種豬細(xì)小病毒NJ株F8 、F18代毒種進(jìn)行病毒培養(yǎng)，通過檢測其病毒含量、血凝價以及制備疫苗免疫機(jī)體的抗體水平等指標(biāo)來進(jìn)行評價。結(jié)果表明，各代次病毒含量為107.2～107.5TCID?50/mL，血凝價為29～210;制苗后免疫陰性豚鼠與后備母豬，免疫28 d后均出現(xiàn)抗體反應(yīng)，HI效價分別為27～29和28～29。不同代次毒種接種不同代次ST細(xì)胞培養(yǎng)的病毒含量、血凝價及疫苗免疫效力均符合要求。各代次細(xì)胞增殖性能穩(wěn)定，培養(yǎng)的PPV NJ株均能滿足獸用生物制品的生產(chǎn)要求。

關(guān)鍵詞豬細(xì)小病毒;ST細(xì)胞;適應(yīng)性

中圖分類號S?852.65+1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0093-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.023

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Adaptation of Porcine Parvovirus to ST Cell Line

TANG Bo1，2，3，4，LIU Guo-yang1，2，3，4，CHANG Chen1，2，3，4 et al（1.Institute of Veterinary Immunology Engineering，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;2.National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;3.Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety-State Key Laboratory Cultivation Base，Ministry of Science and Technology，Nanjing，Jiangsu 210014;4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou，Jiangsu 225009）

AbstractIn order to evaluate the effects of generation change of swine testicle cell on the immunogenicity of NJ strain of porcine parvovirus，the 10th，30th and 60th generations of ST cells were inoculated with F8 and F18 virus of NJ strain of porcine parvovirus and cultured.And the virus content，hemagglutination titer and antibody level of vaccine immune were detected.The results showed the virus content of different generations was 107.2-107.5 TCID?50/mL，the haemagglutinin titer was 29-210.The negative guinea pigs and prepubertal sows were immunized with the prepared vaccine，antibody response appeared after?immunization 28 days，and HI titer were?27-29 and 28-29 respectively.The virus titer，hemagglutination titer and immune efficacy of inoculation with different generations of ST cell were in accordance with the requirements.All generations of cells had stable proliferation performance，PPV NJ strain cultured could meet the production requirements of veterinary biology product.

Key wordsPorcine parvovirus;ST cells;Adaptation

豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)[1]。該病主要引發(fā)初產(chǎn)母豬產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，其他類型豬感染后則無明顯的臨床癥狀[2]。PPV的主要傳染源是帶毒豬，感染豬長期排毒使得其在豬群中很難清除[3]。近年來，隨著規(guī)模化豬場的不斷擴(kuò)大，該病在我國的流行呈上升趨勢[4]。目前血清學(xué)調(diào)查證實國內(nèi)豬群中該病的陽性率超過90%，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前國內(nèi)控制豬細(xì)小病毒病流行的最有效方法仍是滅活疫苗的免疫[6]。豬細(xì)小病毒疫苗生產(chǎn)中常用ST細(xì)胞來增殖病毒，如何獲得滿足生產(chǎn)要求且具有良好免疫原性的ST細(xì)胞適應(yīng)株顯得尤為?重要[7]。

豬細(xì)小病毒NJ株為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所分離及純化獲得的疫苗生產(chǎn)株，該毒株免疫原性良好具有疫苗候選株的潛力。筆者通過研究PPV NJ株不同代次毒種接種不同代次ST細(xì)胞，探討病毒培養(yǎng)含量、血凝價及制備疫苗免疫效力隨著細(xì)胞代次增加的變化，旨在為分析具有良好穩(wěn)定細(xì)胞適應(yīng)性的PPV NJ株是否能夠滿足工業(yè)化大生產(chǎn)要求提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1毒株和細(xì)胞

ST細(xì)胞系購自美國菌種保藏中心（ATCC），9代、29代、59代由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院傳代保存;豬細(xì)小病毒毒種NJ株F8、F18代由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分離并保存。

1.2主要試劑試驗所用DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品。

1.3試驗動物

350～400 g豚鼠（豬細(xì)小病毒HI抗體為陰性），來源于南京青龍山實驗動物中心;5～6月齡陰性后備母豬（豬細(xì)小病毒HI抗體為陰性），購自江蘇明天農(nóng)牧科技公司。

1.4病毒毒價測定

將ST細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中，?0.1 mL/孔，將不同時間段病毒液進(jìn)行10倍稀釋，每個稀釋度分別接種10孔，0.1?mL/孔，置于37?℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄細(xì)胞病變，采用Reed-Muench法計算TCID?50。

1.5血凝（HA）與血凝抑制（HI）抗體的檢測

1.5.1血清樣品的處理。將100 μL血清56 ℃水浴中滅活?30 min后，加入300 μL?25%白陶土懸液，混勻后室溫下作用30 min;10 000 r/min離心10 min，吸取上清后加入100 μL 20%豚鼠紅細(xì)胞，振蕩、混勻后37 ℃下作用1 h;4 000 r/min離心10 min，收集上清即為待檢血清樣品。

1.5.2血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）抗體測定。具體操作方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.6試驗設(shè)計

1.6.1病毒培養(yǎng)。

將傳代后ST細(xì)胞10代、30代、60代培養(yǎng)至生長致密度35%～45%后，分別加入含0.5%豬細(xì)小病毒F8、F18代毒種細(xì)胞維持液，37 ℃下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到75%時反復(fù)凍融3次后收獲。

1.6.2疫苗制備。

分別取各組培養(yǎng)物20?mL，用終濃度0.1%甲醛溶液滅活24 h，經(jīng)滅活檢驗合格后按水油相比1∶3 乳化制備疫苗。

1.6.3豚鼠效力檢驗 。

用體質(zhì)量350～400 g PPV HI抗體陰性（HI效價應(yīng)不高于23）豚鼠5只，各肌肉注射疫苗0.5?mL。28 d后連同對照豚鼠3只采血測定抗體。對照豚鼠應(yīng)為陰性，免疫豚鼠至少應(yīng)有4只出現(xiàn)抗體陽性（HI效價應(yīng)不低于26）。

1.6.4后備母豬效力檢驗。

每批疫苗用5～6月齡豬細(xì)小病毒HI抗體陰性的后備母豬5頭，各肌肉注射疫苗2 mL（1頭份）。28 d后，連同條件相同的3頭對照豬采血并檢測HI抗體?效價。

2結(jié)果與分析

2.1各代次ST細(xì)胞培養(yǎng)病毒的含量和血凝效價測定結(jié)?果

對各代次細(xì)胞培養(yǎng)病毒進(jìn)行檢驗，發(fā)現(xiàn)均無細(xì)菌生長。病毒含量為107.2～107.5TCID?50/mL，血凝效價（HA）為29～210;各代次細(xì)胞培養(yǎng)不同代次的PPV NJ株病毒含量均維持在穩(wěn)定水平（表1）。

2.2疫苗免疫豚鼠HI抗體檢測

每批疫苗免疫28 d后分別采血檢測HI抗體，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，6批疫苗豚鼠血清HI抗體全部陽性效價為 27～29。各免疫組間抗體水平無顯著差異，空白對照則全部為陰性。

2.3疫苗免疫5～6月齡后備母豬HI抗體檢測結(jié)果

每批疫苗分別免疫5～6月齡后備母豬，28 d后采血檢測HI抗體效價。從圖2可以看出，免疫豬抗體全部陽性HI效價為?28～29，對照豬則均為陰性。該試驗結(jié)果表明，第10、30、60代細(xì)胞培養(yǎng)的豬細(xì)小病毒NJ株均具有較好的免疫原性，制備的各批次疫苗在后備母豬上均具有較高的抗體水平。

3討論

國內(nèi)控制豬細(xì)小病毒病流行的最有效方法是疫苗免疫，疫苗質(zhì)量在疾病防控環(huán)節(jié)中尤為關(guān)鍵。豬細(xì)小病毒在ST細(xì)胞上的穩(wěn)定高效培養(yǎng)是研制其疫苗產(chǎn)品的基礎(chǔ)。該研究中的PPV NJ株具有疫苗候選株的潛力，其病毒培養(yǎng)滴度高、免疫原性好[9]。然而，在大生產(chǎn)過程中ST細(xì)胞代次的增高是否會影響PPV NJ株的免疫原性還有待進(jìn)一步研究。石慧穎等[10]報道，乙腦病毒P3株在vero細(xì)胞上傳代后免疫原性會發(fā)生明顯下降。徐滌平等[11]研究表明篩選一株具有良好穩(wěn)定細(xì)胞適應(yīng)性的疫苗候選株對疫苗質(zhì)量至關(guān)重要，確保病毒在不同代次細(xì)胞上的穩(wěn)定增殖水平是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效疫苗的首要?因素。

該研究將ST細(xì)胞10代、30代、60代分別接種豬細(xì)小病毒F8、F18代毒種進(jìn)行病毒培養(yǎng)，隨著細(xì)胞代次的增加，病毒含量、血凝價和免疫效力檢測結(jié)果均未見明顯下降。結(jié)果表明，不同代次毒種接種不同代次ST細(xì)胞培養(yǎng)增殖性能穩(wěn)定，均能符合生產(chǎn)要求，這為后續(xù)相關(guān)疫苗的研制奠定了重要?基礎(chǔ)。

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