nAChRs對急性支氣管哮喘小鼠腎上腺激素分泌的影響

賀素錦

(中國平煤神馬集團職業(yè)病防治院 呼吸內科，河南 平頂山467000)

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的以氣道慢性炎癥為主要病理機制的呼吸道疾患，常表現(xiàn)為咳嗽、反復或持續(xù)性喘息、胸悶氣急，急性發(fā)作時可并發(fā)猝死、嚴重肺部感染、呼吸衰竭等[1，2]。 既往臨床研究顯示[3，4]，氣道慢性炎癥發(fā)生時使支配腎上腺髓質的交感神經(jīng)興奮而釋放乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，腎上腺髓質嗜鉻細胞(adrenM medullary chromafiin cells，AMCCs)的煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)被激活，Ca2+經(jīng)細胞膜上活化的鈣離子通道進入細胞內，使細胞內Ca2+濃度升高，促進去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)、多巴胺(dopamine，DA)、腎上腺素(adrenaline，Adr)釋放。Yu M 等[5]研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者腎上腺髓質nAChRs構成與健康對照組比較發(fā)生顯著性變化，他們推測哮喘患者nAChRs的 α3、α4、α7、β4 亞基構成的變化可能與 AMCCs釋放Adr有密切關系。為進一步證實Yu M等[5]的推測，本研究對172只小鼠進行體內實驗及體外實驗，旨在探討nAChRs對急性支氣管哮喘小鼠腎上腺激素分泌的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選用購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司 (許可證號：SO XK(滬)2007-0005)的7周齡健康SPF級C57B/L雄性小鼠172只，單只體質量25～30g。小鼠飼養(yǎng)于動物實驗室獨立通氣籠中，每籠5只，實驗室室溫維持在25℃，濕度維持在50%，所有小鼠光照12h/d。采用同種無菌飼料對所有小鼠進行投喂，飲水自由，術前禁食12h。采用隨機數(shù)字表法將172只小鼠分為哮喘組(n=86)與對照組(n=86)，兩組小鼠一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。本研究上報動物保護協(xié)會及醫(yī)學倫理委員會并獲得批準。

1.2 實驗藥物與試劑 氫氧化鋁凝膠佐劑購于北京來福賽思科技有限公司；卵清白蛋白(OVA)購于上海斯信生物科技有限公司；ELISA試劑盒購于上海恒遠生物科技有限公司；雙蒸水購于上海喬羽生物科技有限公司；甲基牛扁堿購于上海起發(fā)實驗試劑有限公司；免疫熒光染色試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司；碳酸鹽包被緩沖液購于美國Agdia公司；酶標板購于上海晶安生物科技有限公司；Eppendorf移液槍購于北京卓信偉業(yè)科技有限公司；牛血清白蛋白購于上海恒遠生物科技有限公司；98%濃硫酸購于上海皖科電子科技有限公司；蘇木素購于北京酷來搏科技有限公司；1%鹽酸溶液購于上海銘博生物科技有限公司；伊紅購于上海遠慕生物科技有限公司；梯度酒精購于北京雅康博生物科技有限公司；中性樹膠購于成都麥卡希化工有限公司；10%甲醛溶液購于杭州新喬生物科技有限公司；二甲苯購于上海瑞劍生物科技有限公司。

1.3 實驗方法與評價指標 體內實驗：哮喘組小鼠實驗第0、7d腹腔注射200 ul含1 mg氫氧化鋁凝膠佐劑及10ug OVA的生理鹽水，第14、20d每日給予5%OVA霧化0.5h進行激發(fā)以建立哮喘小鼠模型；對照組小鼠用生理鹽水替代進行腹腔注射及霧化，其余同哮喘組。第2ld采用小鼠肺功能儀(上海玉研科學儀器有限公司)測定兩組小鼠氣道反應性，以生理鹽水激發(fā)的氣道阻力(airway resistance，AR)為基礎值，以不同濃度ACh激發(fā)的AR為激發(fā)值，激發(fā)值/基礎值評價小鼠氣道反應性。采集兩組小鼠外周靜脈血 2ml，3000r/min離心10min，分離血清于-80℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)測定血清中OVA特異性的IgE抗體、Adr水平。取兩組小鼠右肺組織，用10%甲醛溶液固定，修剪，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋成塊，切成5μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，流水沖洗，1%鹽酸溶液分化數(shù)秒，流水沖洗，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE染色結果。

體外實驗：取兩組小鼠腎上腺分離及培養(yǎng)AMCCs，參照Franco A等[6]使用的免疫熒光及電子顯微鏡(美國Aspex公司)鑒定AMCCs。然后進行以下實驗：①AMCCs培養(yǎng)2d后更換新鮮培養(yǎng)基，體積400μl，吹打均勻后取10μl沿蓋玻片邊緣滴加到細胞計數(shù)板上進行細胞計數(shù)，然后換成400μl雙蒸水到孔板中，-20℃和室溫反復凍融3次，收集細胞裂解液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測定細胞裂解液中Adr水平；②AMCCs培養(yǎng)2d后用不同濃度 (1、10、100、1 000、10000nmol/L)ACh 刺激 1min，收集細胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測定細胞上清液中Adr水平；③AMCCs培養(yǎng)2d后換液，加入終濃度為10nmol/L的α7nAChR阻斷劑甲基牛扁堿 (methyllycaconitine，MLA)， 然后用 100 nmol/L的ACh刺激1min，收集細胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測定細胞上清液中Adr水平；④AMCCs培養(yǎng)2d后換液，加入終濃度為30 μmol/L的α7nAChR激動劑PUN-282987直接刺激1min，收集細胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測定細胞上清液中Adr水平；⑤AMCCs培養(yǎng)2d后換液，加入終濃度為10μmol/L的α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID，然后以100nmol/L的ACh刺激1min，收集細胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測定細胞上清液中Adr水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用spss22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠氣道反應性測定結果比較 ACh激發(fā)后哮喘組氣道反應性顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05。見圖1。

圖1 兩組小鼠氣道反應性測定結果比較

2.2 兩組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體及Adr水平比較 哮喘組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；哮喘組小鼠血清中Adr水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05。見表1。

2.3 兩組小鼠HE染色結果比較 哮喘組小鼠支氣管壁及肺泡壁明顯增厚，支氣管及血管周圍可見大量炎癥細胞浸潤；對照組小鼠支氣管及血管周圍未見明顯的炎癥細胞浸潤，見圖2。

表1 兩組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體及Adr水平比較(，ug/l)

表1 兩組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體及Adr水平比較(，ug/l)

組別 造模數(shù)(只) IgE Adr哮喘組對照組Z/t P 86 86/ /10.71±3.88 0.21±0.21-7.968＜0.001 2.08±0.68 2.11±0.75 0.275 0.784

圖2 兩組小鼠HE染色結果×200(A：對照組；B：哮喘組)

2.4 兩組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細胞裂解液中Adr水平比較 哮喘組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細胞裂解液中Adr水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05。見表2。

2.5 兩組小鼠在不同濃度ACh刺激后AMCCs細胞上清液中Adr水平比較 不同濃度ACh刺激后，哮喘組小鼠AMCCs細胞上清液中Adr水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05。見圖3。

表2 兩組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細胞裂解液中Adr水平比較(，ug/l/1000 個)

表2 兩組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細胞裂解液中Adr水平比較(，ug/l/1000 個)

組別 造模數(shù)（只） Adr哮喘組對照組t P 86 86/ /5501.12±793.09 7654.31±987.65 15.764＜0.001

圖3 兩組小鼠在不同濃度ACh刺激后AMCCs細胞上清液中Adr水平比較

2.6 α7nAChR阻斷劑MLA對兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響 使用α7nAChR阻斷劑MLA后，在受到ACh刺激時哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05。見圖4。

圖4 α7nAChR阻斷劑MLA對兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響

2.7 α7nAChR激動劑 PUN-282987對兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響 使用α7nAChR激動劑PUN-282987直接刺激時哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05。 見圖5。

圖5 α7nAChR激動劑PUN-282987對兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響

2.8 α3β4-nAChR 阻斷劑 α-CTx TxID對兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響 使用α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID后，在受到ACh刺激時兩組小鼠AMCCs分泌Adr的能力均顯著下降，且哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05。見圖6。

圖6 α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID對兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響

3 討論

引發(fā)哮喘的因素很多，呼吸道病毒感染、環(huán)境氣候改變、氣道神經(jīng)調節(jié)失常等可引起機體出現(xiàn)廣泛而多變的可逆性氣流受限從而引發(fā)持續(xù)性喘息，常在夜間和/或清晨加重，急性發(fā)作時可出現(xiàn)低氧血癥、多臟器衰竭甚至死亡，嚴重影響哮喘患者生命質量。有研究顯示發(fā)生氣道重塑時，支配腎上腺髓質交感神經(jīng)興奮而釋放ACh，促使AMCCs的nAChRs激活，Ca2+通道活化，細胞內Ca2+濃度升高，繼而促進Adr分泌。因此，探討nAChRs對急性支氣管哮喘小鼠Adr分泌的影響，可為支氣管哮喘的發(fā)病機制及防治靶點的研究提供新的方向。既往研究結果顯示，部分哮喘大鼠的AMCCs向神經(jīng)元轉分化，導致Adr合成減少。而Yu M等[5]發(fā)現(xiàn)哮喘患者血漿中Adr水平與健康對照者比較無顯著性差異，這一研究結果與本研究結果類似。造成這種矛盾現(xiàn)象的機制尚未完全明確，我們推測在哮喘小鼠AMCCs合成Adr減少的情況下，可能有其它代償機制促進AMCCs分泌Adr，最終維持哮喘發(fā)作時患者血漿中Adr水平無明顯波動。

相關研究發(fā)現(xiàn)[6]哮喘小鼠AMCCs的nAChRs中 α3、α4、α7、β4 亞基 mRNA 表達升高，但具體機制并未闡明。在神經(jīng)細胞中，ACh是在膽堿乙酰化酶(choline acetylase，chAT)催化作用下合成的。有研究認為[7]哮喘與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)被其相應自身抗體損傷顯著相關。AChR包括毒蕈堿型受體(M受體)與煙堿型受體(N受體)，其中N受體為一類膽堿能受體，N1受體位于交感和副交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的突觸后膜，可引起神經(jīng)元興奮，N2受體位于骨骼肌終板膜，可引起骨骼肌興奮[8，9]。煙堿型受體又為離子通道型受體，其信號分子為神經(jīng)遞質，神經(jīng)遞質與受體結合后通道蛋白構象發(fā)生變化，細胞膜離子通透性增強，離子通道開啟，使細胞外化學信號轉換為電信號，進而改變突觸后細胞興奮性[10，11]。除外，每個離子通道型受體由5個亞基組成，α1-10、β1-4、?等為已經(jīng)確認的亞基，且不同亞基組成生理學特性不同的nAChR，由于α7nAChR通常形成亞基單一的同源五聚體，故在所有亞基中α7nAChR對Ca2+的通透性最高[12]。同時，我們前期研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠α7nAChR mRNA表達水平顯著高于 α3nAChR mRNA、α4nAChR mRNA、β4nAChR mRNA，由此我們推測在哮喘小鼠AMCCs合成Adr減少的情況下，α7nAChR可能代償促進AMCCs分泌Adr，使哮喘患者血漿中Adr維持在正常水平。Wong D F等[13]建立動物模型進行實驗發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠注射α7nAChR激動劑PUN-282987后血清中Adr水平上升，注射α7nAChR阻斷劑MLA后血清中Adr水平降低。然而在本研究中，使用α7nAChR阻斷劑MLA或α7nAChR激動劑PUN-282987后，哮喘小鼠在受到ACh刺激時AMCCs分泌Adr的能力與對照組比較均無統(tǒng)計學差異，均不能促進AMCCs釋放Adr。分析其原因可能是因為，表達α7nAChR的哮喘小鼠AMCCs缺乏苯乙醇胺-N-甲基轉移酶(phenylethanolamine Nmethyl transferase，PNMT)而不能合成Adr[14，15]。這一結果也較好地提示了以往實驗中給予α7nAChR阻斷劑MLA或α7nAChR激動劑PUN-282987所造成的哮喘小鼠血清中Adr水平變化可能為藥物的間接作用。相關研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠AMCCs的α3nAChR mRNA、α4nAChR mRNA表達增高，并且考慮到α3nAChR mRNA特異性阻斷劑的可獲得性，本研究探討了α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID對兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響，結果顯示使用α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID后，在受到ACh刺激時兩組小鼠AMCCs分泌Adr的能力均顯著下降，且哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力明顯低于對照組，提示α3β4-nAChR參與兩組小鼠 AMCCs分泌 Adr，且哮喘小鼠α3β4-nAChR表達明顯高于健康對照小鼠。我們推測α3β4-nAChR表達增加可能是對AMCCs分泌Adr減少的一種代償性反應，以便機體在受到外界因素刺激時能更好地釋放Adr進行應激調節(jié)。

綜上，急性支氣管哮喘小鼠nAChRs亞基構成的改變參與調控AMCCs分泌腎上腺素。由于本研究造模數(shù)較少，且研究時間短，還需擴大樣本作進一步研究。