響應(yīng)面法優(yōu)化疊鞘石斛多糖超聲提取工藝

牟蘭 田孟良 劉建橋 趙中瑩 楊小倩 黃雪麗 劉帆

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130)

疊鞘石斛(Dendrobium anrantiacumRchb.var.denneanum(Kerr.)Z.H.Tsi)，多年生草本，蘭科，線葉石斛變種[1]，又名，迭鞘石斛。藥材為蘭科植物疊鞘石斛的新鮮或干燥莖[2]。清代《植物名實(shí)圖考》記載其為：“金蘭即石斛之一種，花如蘭而瓣肥短，色金黃有光灼”[3-5]。性味甘，微寒，歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，用于陰傷津虧，口干煩渴，病后虛熱等證[2]。主要分布于四川，云南、貴州、臺灣等地亦有少量分布[5-6]，疊鞘石斛對生態(tài)環(huán)境要求十分苛刻，因其種子細(xì)小，僅具有未分化的原胚，不含可供萌發(fā)與生長的營養(yǎng)成分，因此石斛的繁殖率低，生長速度緩慢，自然更新能力差[7]，從而導(dǎo)致了優(yōu)質(zhì)的野生疊鞘石斛數(shù)量極為稀少。

疊鞘石斛化學(xué)成分主要有多糖、聯(lián)芐類、倍半萜、香豆素和甾體等，其中多糖為主要成分[8-9]。石斛多糖是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子。Luo等[10]從疊鞘石斛中分離的多糖DDP的結(jié)構(gòu)解析為：分子質(zhì)量484.7kDa，單糖組成，n(Arab):n(Xyl):n(Man):n(Glc):n(Gal)為1.0:2.66:8.92:34.2:10.16。疊鞘石斛多糖具有多種生物活性。如在抗菌性方面，疊鞘石斛多糖水體物對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，其抗菌機(jī)制可能涉及影響小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的細(xì)胞膜通透性和核酸合成[11]；在抗腫瘤方面，羅傲雪[12]研究了疊鞘石斛多糖對人肝癌細(xì)胞和人正常肝臟細(xì)胞的藥物抑制作用。結(jié)果顯示，160μg/mL疊鞘石斛多糖作用48h能顯著抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-721的生長，且相同條件下對正常人肝臟細(xì)胞HL-7702的影響較小。表明疊鞘石斛多糖可能是一種毒副作用較小的抗腫瘤藥物。并且，以S180肉瘤模型小鼠為研究對象，疊鞘石斛多糖在高、中、低3個濃度組抑瘤效果均較好(P＜0.05)，其中0.625mg/mL為其體內(nèi)最佳抑瘤濃度；在抗氧化能力方面，疊鞘石斛多糖能顯著增強(qiáng)荷瘤小鼠血清中SOD活力，降低MDA含量[12]。薛倩倩等[13]研究也表明，疊鞘石斛多糖對DPPH自由基、羥基自由基具有較好的清除率，對Fe2+也具有很好的螫合率，對脂質(zhì)過氧化有明顯的抑制作用；在增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面，范益軍等[14]研究得出，不同濃度的疊鞘石斛多糖表現(xiàn)出不同的免疫活性，其中多糖低濃度組(1.25mg/mL)有較高的腫瘤抑制率和免疫指數(shù)(P＜0.01)，并促進(jìn)和調(diào)節(jié)IL-2、IFN-γ、TNF-α在機(jī)體內(nèi)分泌(P＜0.01)，協(xié)調(diào)改善機(jī)體免疫系統(tǒng)功能。在降血糖方面，羅傲霜等[15]研究結(jié)果表明，迭鞘石斛多糖能顯著降低四氧嘧啶高血糖小鼠空腹血糖，增強(qiáng)四氧嘧啶高血糖大鼠的糖耐量，而對正常小鼠空腹血糖和正常大鼠糖耐量沒有明顯影響。綜上所述，疊鞘石斛多糖具有多種重要的生物活性，有著極高的藥用價值[16-19]。

石斛多糖的提取方法包括水取法[20]、酶提法[21]、超聲輔助法[22]、微波輔助法[23]、超高壓輔助法[24]和濕法超微粉碎輔助法[25]等。超聲輔助法是利用超聲空化現(xiàn)象，使細(xì)胞滲透效應(yīng)與毛細(xì)管效應(yīng)增強(qiáng)，有效成分得以釋放后與溶劑充分混合。該方法不僅可縮短提取時間，提高提取率，還可以避免高溫對有效成分的影響[26]。而響應(yīng)面法具有優(yōu)化時間短，應(yīng)用可信度高，求得的回歸方程精度高，能夠快速準(zhǔn)確地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，并且兼顧試驗(yàn)隨機(jī)誤差等諸多優(yōu)點(diǎn)[27-28]，有利于疊鞘石斛多糖提取工藝優(yōu)化。目前，利用超聲波輔助和響應(yīng)面法優(yōu)化疊鞘石斛多糖提取工藝尚未見報(bào)道。為了探索疊鞘石斛多糖最佳的提取條件，更好地提高珍稀原材料的利用率，本實(shí)驗(yàn)以3年生疊鞘石斛為研究對象，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用Box-Behnken響應(yīng)面法對疊鞘石斛多糖超聲提取工藝[29]進(jìn)行優(yōu)化，為疊鞘石斛資源的深層次開發(fā)利用提供了理論參考及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)對象

3年生疊鞘石斛新鮮植株(采自四川省雅安市石棉縣，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院田孟良教授鑒定為疊鞘石斛)。

1.1.2 試驗(yàn)藥品

無水苯酚、無水葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、正丁醇、三氯甲烷，丙酮均為分析純試劑。

1.1.3 試驗(yàn)器材

LX-03型粉碎機(jī)；滾筒殺青機(jī)；JD500-3型電子天平；KQ-4001KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器；DHG-9140A型干燥箱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52 AA；UV-1800分光光度儀；Thermo高速離心機(jī)等。

1.1.4 數(shù)據(jù)處理使用

Microsoft Excel 2016、DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Design-Expert.8.05b等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.2 方法

1.2.1 疊鞘石斛材料處理方法

隨機(jī)抽取生長健壯、無病蟲害的3年生新鮮疊鞘石斛莖段，去除其表面葉片和雜質(zhì)，經(jīng)蒸餾水清洗干凈，吸水紙吸干，剪成1cm左右長的小段。于滾筒殺青機(jī)中快速殺青，再使用干燥箱80℃烘干至恒重。取出干燥好的疊鞘石斛，在粉碎機(jī)中粉粹并過20目篩，最后貯藏于4℃冰箱備用。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察不同水平的超聲功率(200、240、280、320、360和400W[30])；超聲溫度(30、40、50、60、70和80℃[31])、超聲時間(15、20、25、30和35min[32])對疊鞘石斛多糖得率的影響。

1.2.3 疊鞘石斛粗多糖提取

精確稱取疊鞘石斛粉樣3.0g，按單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別超聲提取3次，合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積。向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，攪拌，至混合液乙醇濃度為 80%，4℃過夜、過濾、冷凍干燥得疊鞘石斛粗多糖。

1.2.4 疊鞘石斛精制

多糖的制備取石斛粗多糖，蒸餾水溶解。Sevag試劑(正丁醇:三氯甲烷=1:4)萃取去除蛋白質(zhì)，重復(fù)萃取至無沉淀生成。紫外-可見光掃描無明顯蛋白質(zhì)吸收峰說明蛋白質(zhì)已經(jīng)除凈。用透析袋48h流水透析，蒸餾水透析24h，除去無機(jī)鹽、小分子雜質(zhì)及色素，將透析袋內(nèi)多糖液醇沉，過濾得沉淀，無水乙醇、丙酮各洗2遍，真空冷凍干燥至恒重即為疊鞘石斛精多糖。

1.2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制

準(zhǔn)確稱取0.50g無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于50mL的容量瓶中，加蒸餾水溶解、定容、搖勻，即為10mg/mL的葡萄糖母液，再準(zhǔn)確吸取5mL于100mL量瓶中，用蒸餾水定容即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于20mL具塞試管中，用蒸餾水定容至10mL，再往試管中加入5%的苯酚溶液1.0mL，然后快速加入98%濃硫酸5.0mL，靜置10min，使反應(yīng)液充分混合，然后將試管放置于30℃水浴中反應(yīng)20min，于488nm處測吸光度值，以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程為：y=7.7791x+0.1137(R2=0.9972)。

1.2.6 疊鞘石斛多糖含量的測定方法

采用苯酚-硫酸法[33]，對疊鞘石斛多糖進(jìn)行測定。將疊鞘石斛精多糖1mg溶于1mL蒸餾水得樣品溶液，取100μL樣品溶液+200μL 5%苯酚溶液+1mL濃硫酸，在488nm處檢測吸光度。參照寇瑩瑩等[34]的方法配制5%的苯酚溶液。

1.2.7 疊鞘石斛多糖提取率的計(jì)算

提取率(%)=測得多糖含量/疊鞘石斛粉質(zhì)量(干重)×100%。

1.2.8 Box-Behnken響應(yīng)面法分析

通過單因素試驗(yàn)，找到上述3個考察因素中多糖提取率最大值的條件，將最大值條件標(biāo)記為“0”，位于最大值左右兩邊的條件分別記為“-1”和“1”，得到3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)[35]，并進(jìn)行由軟件生成的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)。同時，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測超聲輔助提取疊鞘石斛多糖的最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對疊鞘石斛多糖的影響

疊鞘石斛多糖提取率與超聲功率的關(guān)系的結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，在200～320W范圍內(nèi)，疊鞘石斛多糖提取率隨著超聲功率提高而增高，在超聲功率320W時多糖提取率達(dá)到最大值，此后再增大超聲功率，多糖提取率開始下降。以320W為多糖超聲功率中心試驗(yàn)點(diǎn)。

圖1 超聲功率對疊鞘石斛多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction of polysaccharides from Dendrobium denneanum

2.1.2 超聲溫度對疊鞘石斛多糖提取率的影響

疊鞘石斛多糖含量與超聲功率關(guān)系如圖2所示。圖2表明，超聲過程中溫度對疊鞘石斛多糖提取得率有較為明顯的影響，在30～70℃范圍內(nèi)，溫度升高多糖提取率增大，且在60～70℃時，多糖提取率增長最快。在超聲溫度為70℃時多糖提取率達(dá)到最大值，此后再增大，多糖提取率開始下降。因此選擇70℃為多糖超聲溫度中心試驗(yàn)點(diǎn)。

圖2 溫度對疊鞘石斛多糖提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide extraction from Dendrobium denneanum

2.1.3 超聲提取時間對疊鞘石斛多糖提取的影響

疊鞘石斛多糖提取率與提取時間的關(guān)系如圖3所示。從圖3可以看出，在超聲時間15～25min范圍內(nèi)，疊鞘石斛多糖提取率隨著超聲時間延長而增加，超聲時間至25min時多糖提取率達(dá)到最大值。此后再延長超聲時間，多糖提取率有降低趨勢。綜合考慮，選擇25min為多糖提取超聲時間中心試驗(yàn)點(diǎn)。

圖3 提取時間對疊鞘石斛多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction of polysaccharides from Dendrobium denneanum

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法分析

2.2.1 模型建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇標(biāo)準(zhǔn)偏差值最大的3組實(shí)驗(yàn)因素作為下一步實(shí)驗(yàn)因素，選取了超聲功率、溫度、提取時間3個因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，將這3個因素中多糖提取率最大值條件標(biāo)記為“0”，位于最大值左右兩邊的條件分別記為“-1”和“1”[35]，如表1所示。

使用Design-Expert.8.05b軟件生成17個處理的試驗(yàn)，從而考察各因素之間相互作用以及對疊鞘石斛多糖提取率的影響，如表2所示。

2.2.2 回歸模型的擬合方差分析

使用Design-Expert.8.05b對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析，得出二次回歸統(tǒng)計(jì)分析表，如表3所示，在這里A：超聲功率；B：溫度；C：時間。最后，通過軟件分析得到疊鞘石斛多糖提取率的回歸方程如下：多糖含量=27.12-0.44×A+0.59×B-0.047×C-0.70×AB+1.03×AC-2.26×BC-2.62×A2-1.43×B2-1.53×C2。

表1 疊鞘石斛多糖響應(yīng)面的因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 Factor level design of response surface of polysaccharides from dendrobium denneanum

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of response surface of polysaccharides

從表3的數(shù)據(jù)分析，回歸模型P＜0.0001，達(dá)到了顯著的水平，說明該二次回歸模型是有意義的。此外，該回歸模型R2=0.9851，說明擬合程度比較良好。擬失項(xiàng)P=0.1307，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.05，影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化疊鞘石斛多糖超聲提取工藝條件

根據(jù)得出的回歸方程對超聲功率、溫度、時間3個因素繪制響應(yīng)面圖(圖4～6)，各圖代表的是3個因素中的兩個因素對疊鞘石斛多糖提取率的影響，能夠體現(xiàn)出因素之間的交互作用，圖中的底端黃色部分是等高線。由圖4～6這3個響應(yīng)曲面圖可以看出各個因素對疊鞘石斛多糖提取率的影響，從圖中分析得到溫度對疊鞘石斛多糖提取率的影響最為顯著，三者的主效應(yīng)關(guān)系為：溫度(B)＞超聲功率(A)＞時間(C)，其中溫度與時間的響應(yīng)曲面最為陡峭，證明溫度與時間的交互作用最為強(qiáng)。通過使用Design-Expert.8.05b軟件對回歸方程求解，得到疊鞘石斛多糖超聲提取工藝條件為：超聲功率320W，溫度80℃，提取時間20min，理論多糖提取率為27.53%。經(jīng)3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)得到的多糖提取率平均值為27.05%，與理論值的誤差僅為1.74%。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析Tab.3 Variance analysis of two regression equation of response surface

圖4 超聲功率(A)與溫度(B)對疊鞘石斛多糖提取率影響的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface of ultrasonic power(A)and temperature(B)to the extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum

圖5 超聲功率(A)與時間(C)對疊鞘石斛多糖提取率影響的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface of ultrasonic power(A)and time(C)to the extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum

圖6 溫度(B)與時間(C)對疊鞘石斛多糖提取率影響的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface temperature(B)and time(C)to the extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum

2.2.4 4種不同提取工藝下疊鞘石斛多糖最佳得率的差異顯著性分析

對最佳提取超聲功率、最佳提取溫度、最佳提取時間3個單因素條件下獲得的疊鞘石斛多糖與最優(yōu)響應(yīng)面法獲得的疊鞘石斛多糖得率進(jìn)行顯著性差異分析，得出最佳響應(yīng)面法獲得的疊鞘石斛多糖得率在P＜0.05水平與3個最佳單因素提取條件下的得率有顯著性差異。在P＜0.01水平與最佳提取超聲功率和最佳提取溫度條件下獲得的疊鞘石斛多糖差異顯著(圖7)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 疊鞘石斛多糖不同提取工藝的對比

疊鞘石斛多糖提取工藝主要分為傳統(tǒng)的水浴回流法和超聲提取法[36-37]，羅傲雪等[38]對疊鞘石斛多糖進(jìn)行傳統(tǒng)的水浴回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為：加水量300mL，回流3次，每次1.5h，多糖提取率為23.38%。與本試驗(yàn)相比較，結(jié)果說明本試驗(yàn)優(yōu)化的超聲工藝條件更佳，并且通過對比更加應(yīng)證超聲提取法操作更為簡便，操作時間更短，更節(jié)能。

圖7 不同最佳提取工藝條件下疊鞘石斛多糖得率Fig.7 The extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum under different optimum conditions

3.1.2 優(yōu)化提取工藝的不同分析方法對比

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，李旻[39]用乙醇回流提取疊鞘石斛多糖，苯酚-硫酸比色法測定在16.12%～17.51%之間，平均含量為16.84%。范益軍等[40]使用正交分析法對疊鞘石斛多糖的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。得到的最佳條件為：溫度100℃、時間25min、pH=7，在此條件下疊鞘石斛多糖的平均提取得率為15.3%，而本試驗(yàn)的提取率為27.53%，結(jié)果說明響應(yīng)面法比正交分析法獲得的工藝條件更佳。張明會等[41]比較了響應(yīng)面法與正交分析法設(shè)計(jì)提取天麻素，得出結(jié)論響應(yīng)面法分析的提取率比正交分析法分析的提取率高出5.63%，黃菊等[42]比較了響應(yīng)面法和正交分析法優(yōu)化蕎麥的蘆丁，得出結(jié)論響應(yīng)面法分析的提取率比正交分析法分析的提取率高出6.91%。因此，在響應(yīng)面分析方法與正交分析法的對比中，響應(yīng)面法得出的結(jié)果更優(yōu)。

3.2 結(jié)論

本次試驗(yàn)使用了Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化疊鞘石斛多糖超聲工藝提取的最優(yōu)條件，即疊鞘石斛多糖超聲提取工藝條件為：提取溫度 80℃，提取時間20min，超聲功率320W，理論多糖提取率為27.53%，經(jīng)3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)得到的多糖提取率平均值為27.05%，與理論值的誤差僅為1.74%，證明此次試驗(yàn)使用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的，具有實(shí)際應(yīng)用價值。疊鞘石斛多糖的超聲提取法條件經(jīng)過優(yōu)化后，可以實(shí)現(xiàn)從疊鞘石斛原材料中提取更多的石斛多糖，從而節(jié)約了疊鞘石斛資源，對后續(xù)進(jìn)一步研究疊鞘石斛多糖成分具有一定的指導(dǎo)意義，并對疊鞘石斛多糖提取的工業(yè)化有一定的應(yīng)用價值。