草莓脫毒技術研究進展

彭芳芳 魏召新 洪林 楊蕾

摘 ? 要 ?草莓味道甜美、營養(yǎng)豐富，還有較高的藥用價值，深受廣大消費者的喜愛。但草莓病害較多，生產用藥較為頻繁，嚴重影響了果實食用安全性。隨著消費者的食品安全意識不斷提高，對草莓的品質也提出了更高的要求。脫毒苗的應用滿足了綠色農業(yè)及草莓產業(yè)現代化發(fā)展需求，對產業(yè)興旺起到積極促進的作用。從組織培養(yǎng)脫毒、熱處理脫毒、超低溫脫毒等方面綜述草莓脫毒技術研究進展，并提出展望。

關鍵詞 ? 草莓;組織培養(yǎng)脫毒;熱處理脫毒;超低溫脫毒

中圖分類號：S668.4 ? ?文獻標志碼：C ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.25.009

近年來，在發(fā)展特色效益農業(yè)政策的引導下，草莓產業(yè)發(fā)展越來越受到新型農業(yè)經營主體的青睞和重視，草莓種植面積日益擴大，隨之而來的病害發(fā)生日漸頻繁，植株矮化、產量下降、品質變劣等負面效應接踵而至[1]。目前，已報道的草莓病害有25種之多，造成草莓大幅減產，經濟損失巨大[2]，其中已查明的4種病毒病嚴重威脅著草莓產業(yè)的發(fā)展：草莓斑駁病毒病、草莓輕型黃邊病毒病、草莓鑲脈病毒病、草莓皺縮病毒病[3]，植株一旦染病，很難防治。目前，草莓脫毒苗的增產效應日益凸顯，與常規(guī)苗相比，脫毒苗的抗病性強、苗株高、長勢強、產量好、果實可溶性固形物含量高[4]，因此，培養(yǎng)和推廣脫毒苗是提高草莓產業(yè)經濟效益的必經之路。本文圍繞草莓的這4種主要病毒病，從組織培養(yǎng)脫毒、熱處理脫毒及低溫處理脫毒等技術展開綜述。

1 草莓組織培養(yǎng)脫毒

組織培養(yǎng)脫毒是獲取無毒苗的一條重要途徑，在對患病草莓有效脫毒的同時，還可以保持親本的優(yōu)良性狀，提高繁育能力，該技術已在生產實踐中得到了廣泛應用，通常選取莖尖或花粉進行培養(yǎng)。

1.1 草莓莖尖培養(yǎng)脫毒

莖尖培養(yǎng)脫毒是在無菌環(huán)境下切取適當莖尖生長點接種于最佳誘導培養(yǎng)基上，進行離體培養(yǎng)獲得無毒苗的一種方法，莖尖的大小選取直接關系著培養(yǎng)及脫毒效果，因為病毒在沒有植物維管束的分生區(qū)域內，需依靠胞間連絲進行傳遞，但由于分生區(qū)域的細胞分裂、生長速度較快，病毒的傳遞速度遠不及其活躍程度，所以生長點帶病毒含量極低[5]。同時，莖尖中內源生長素含量對病毒增殖起到很好的抑制作用，這也是莖尖被廣泛用于植物組織培養(yǎng)外植體的重要原因[6]。1962—1963年，Belkengren[7]、Miller[8]等人首次采用莖尖培養(yǎng)獲得草莓脫毒苗;1984年，國內鄧明琴等人[9]采用草莓莖尖組織培養(yǎng)獲取無毒苗取得了初步成效。此后，草莓的莖尖培養(yǎng)脫毒技術便取得突飛猛進的發(fā)展。針對草莓斑駁病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓鑲脈病毒、草莓皺縮病毒這4種常見病毒，張志宏等人[10]采用莖尖培養(yǎng)、熱處理、藥劑處理三種脫毒方法，比較評價了其脫毒效應，結果表明取0.5 mm莖尖作為外植體進行組織培養(yǎng)是獲得草莓無毒苗最適宜的辦法，病毒脫除率及分化成苗率均達到70%以上。楊波等人[11]取0.4 mm莖尖接種于MS培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，經檢測發(fā)現：組培苗中輕型黃邊病毒和斑駁病毒的脫毒率為100%，鑲脈病毒的脫毒率為82%，表明單純的莖尖培養(yǎng)對脫毒效果仍有一定的局限。高遐虹等人[12]采用莖尖二次脫毒的方法，4種病毒的脫除率達100%。莖尖培養(yǎng)及重復莖尖培養(yǎng)雖然是獲得無毒苗的有效手段，但存在耗時長、工作效率低的問題，探索更高效、更便捷的脫毒方法勢在必行。

1.2 花藥培養(yǎng)脫毒

花藥培養(yǎng)脫毒是將植物體發(fā)育到一定階段的花藥，接種于適宜的誘導培養(yǎng)基上，形成愈傷組織，從而分化成完整無毒植株的過程。有研究表明花藥培養(yǎng)脫毒率之所以能達到100%，是由于病毒難以到達花藥等繁殖器官[13]。同時，花藥培養(yǎng)形成的脫毒苗生長勢強、耐熱能力強、生長健壯，故花藥組織培養(yǎng)已成為獲得無毒苗的重要手段[14-15]。1974年，日本大澤勝次[16]首次發(fā)現花藥可培養(yǎng)產生無病毒植株，這一發(fā)現開啟了花藥培養(yǎng)的“一扇大門”，此后，花藥培養(yǎng)方法日漸成熟。研究發(fā)現花蕾的大小直接關系著花藥的發(fā)育情況[17]。一般情況下，草莓花藥單核期為培養(yǎng)的最佳時期，此時花蕾直徑約為4 mm，是誘導愈傷組織和分化不定芽的最適宜時期，誘導率比花粉發(fā)育初雙核期高6倍左右[18]。龍照春等人[19]對比了莖尖培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、幼葉培養(yǎng)、愈傷組織誘導及分化、加熱處理等幾種方式的脫毒效率，發(fā)現花藥培養(yǎng)脫毒率可達100%，其愈傷組織誘導培養(yǎng)基為LS+2 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 NAA，誘導率可達92.8%;不定芽的誘導培養(yǎng)基為LS+2 mg·L-1 BA+0.3 mg·L-1 NAA，分化率10%;生根培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1 IBA，生根率100%?；ㄋ幣囵B(yǎng)雖在組培脫毒苗應用中具有明顯優(yōu)勢，但花藥再生遺傳變異是一個客觀存在的問題，需要探索一套標準化的技術流程或數據庫系統(tǒng)來解決[20]。相對而言，花藥培養(yǎng)再生率較低，在花藥接種前，如將目標花蕾離體做低溫處理，花藥愈傷組織出愈率將會得到顯著提高[21]。研究發(fā)現最適花藥低溫處理時間為

72 h，出愈率能達到58%[22]。

2 熱處理脫毒

熱處理脫毒是根據病毒粒子對高溫耐受程度的不同，采用不同的處理溫度，使病毒鈍化失活。單純的熱處理脫毒要結合病毒本身耐受性做適當溫度調整，草莓斑駁病耐熱性較弱，37～38 ℃恒溫處理10～14 d;草莓鑲脈病耐熱性較強，42 ℃處理10～14 d;草莓皺縮病有很強的耐高溫性，38 ℃恒溫處理或35～41 ℃變溫熱處理數周才可以達到較好脫毒效果 [23]，整體來看，工作效率較低。1960年下村指出，取0.3 mm以下的莖尖，結合熱處理方法，將可能達到100%的脫毒效果，這一發(fā)現克服了單純熱處理脫毒和莖尖脫毒的時間問題和技術問題，實現了互補效果。劉健[24]、李志強[25]等人切取40 ℃水浴4 h后的0.3～0.5 mm莖尖進行培養(yǎng)后檢測，發(fā)現4種病毒全部脫毒。陳英等人[26]發(fā)現，經高溫處理后，取莖尖長度為0.2～0.3 mm，脫毒效果較好;當莖尖長度為0.5～0.8 mm時，僅SVBV病毒未脫除，可能和其耐熱性有關[27]。研究發(fā)現，先進行莖尖培養(yǎng)后再做熱處理，脫毒率及成活率將顯著提高[28]。

有些學者將熱處理和低溫處理混合使用，在保證脫毒效果的同時，進一步降低了對莖尖大小選取的限制，可將莖尖選取范圍擴大到1.0～1.5 mm，其再生率和病毒脫除率分別可達到33%～76%和30%～100%[29]。

3 超低溫脫毒

超低溫脫毒是將植物離體材料預處理后置于液氮中做冷凍處理，后經解凍再生的一種技術，可實現植物脫毒和種質資源保存的雙重目標。超低溫脫毒的理想材料一般為經低溫處理后遺傳性狀較為穩(wěn)定的分生組織、莖尖等[30]。與傳統(tǒng)方法相比，超低溫技術的脫毒率較高，且不依賴于莖尖大小[31]，有效克服了莖尖培養(yǎng)脫毒的技術難題[32]。盛宏亞[33]、蔡斌華[34]取1～2 mm帶病草莓莖尖，利用玻璃化超低溫分別在脫除草莓斑駁病毒及草莓輕型黃邊病毒兩類單一病毒方面取得較好的效果，脫毒率在95%以上，但該方法的不足之處是存活率較低。羅婭等人[35]探索出了一套既能保證成活率，又能有效脫除病毒的超低溫體系：在0.3 mol·L-1蔗糖溶液中暗培養(yǎng)7 d，室溫下60%PVS2裝載60 min，然后在0 ℃下用100%PVS2玻璃化處理60 min，再用液氮處理1 d后，38～40 ℃水浴2 min，成活率可達68.89%，病毒脫除率100%。其中，PVS2處理是關鍵性技術，處理不當將會嚴重影響莖尖成活率。在草莓脫毒的整個過程中，要經歷低溫、滲透、有氧等一系列逆境，可能會使草莓遺傳信息發(fā)生一定的變化。朱文濤等人[36]采用AFLP和MSAP技術對超低溫技術處理后的草莓做了遺傳穩(wěn)定性研究，AFLP技術分析說明超低溫處理后草莓未發(fā)生遺傳變異，MSAP技術進一步分析發(fā)現超低溫后草莓DNA甲基化與去甲基化分別為5.70%和12.43%，遺傳穩(wěn)定性受到了一定程度的影響，也有學者認為這可能是一種逆境適應表現[37]。

4 展望

草莓病毒病大多為復合病毒感染，單一應用莖尖脫毒、花藥脫毒、熱處理脫毒、超低溫脫毒方法，不能達到很好的效果，一般情況下會采取多種方法混合使用，嚴格來講，還要注意切取目標的大小、時間、形態(tài)，操作較為繁瑣。而目前，化學藥劑脫毒、原生質體培養(yǎng)脫毒研究相對較少，在今后的研究中，可進行探索性研究，進一步拓寬脫毒手段。傳統(tǒng)的方法在操作等方面具有一定的局限性，而植物基因工程的發(fā)展，為草莓品質化發(fā)展開辟了新天地，例如Katchen Julliany P. Silva[38]等人利用擬南芥模型中發(fā)現的一種被稱為系統(tǒng)獲得抗性（SAR）的自然抗病機制，將擬南芥NPR1基因（AtNPR1）導入二倍體草莓中，獲得了對炭疽病、白粉病和角化葉斑病具有抗性的草莓株系。該方法從理論上可選擇多種抗性基因來抵御各類病毒的侵染，發(fā)展?jié)摿薮?。同時，也可探索通過注射病毒疫苗來增強苗木本身對病毒的免疫能力，從而減少病害的發(fā)生。總之，草莓脫毒在技術上雖然取得了一定的進展，但是更簡單、易操作、更長久的脫毒方法還需要進一步探索，脫毒技術研究工作任重而道遠。

參考文獻：

[1] 艾尚杰，張玉連，孫璽如，等.草莓“夢”脫毒苗生根和移栽技術研究[J].種子科技，2018，36（5）：114-115.

[2] 朱海生，花秀鳳，陳敏氡，等.四種草莓病毒SMoV、SVBV、SCV、SMYEV多重RT-PCR檢測[J].核農學報，2013，27（11）：1630-1635.

[3] 楊肖芳，苗立祥，張豫超，等.浙江省紅顏草莓鑲脈病毒（SVBV）的調查與莖尖脫毒技術研究[J].核農學報，2015，29（9）：1694-1700.

[4] 王峰.草莓脫毒苗與常規(guī)苗田間性狀比較試驗[J].山西果樹，2016（2）：10-11.

[5] 金美芳，曹智，蔡俊杰，等.花草莓的組織培養(yǎng)與快繁技術研究[J].廣西植物，2017，37（11）：1395-1405.

[6] García-Gonzáles R， Quiroz K， Caligari PDS， et al. Plant tissue culture： current status， opportunities and challenges[J]. Ciencia e Investigación Agraria， 2010，37（3）：5-30.

[7] Belkengren RO， Miller PW. Culture of apical meristems of Fragaria vesca strawberry plants as a method of excluding latent A virus[J]. Plant Disease Report，1962， 46：119-121.

[8] Miller PW， Belkengren RO. Elimination of yellow edge， crinkle， and veinbanding viruses and certain other virus complexes from strawberries by excision and culturing of apical meristems[J]. Plant Disease Report，1963，47：298-300.

[9] 鄧明琴.草莓無毒苗初報[J].上海農業(yè)科技，1986（4）：3-4.

[10] 張志宏，肖敏，楊洪一，等.草莓病毒脫除方法的比較與評價[J].果樹學報，2006，23（5）：720-723.

[11] 楊波，趙寶龍，孫軍利，等.草莓新品種京藏香莖尖組培快繁技術研究[J].黑龍江農業(yè)科學，2018（7）：30-35.

[12] 高遐虹，李梅.提高草莓莖尖組織培養(yǎng)脫毒效率研究[J].中國果樹，1994，14（2）：5-6.

[13] 孫崇波，蔣桂華，施季森，等.不同外植體對草莓病毒脫除效果及病毒的多重RT-PCR檢測[J] .核農學報，2008，22（4）：447-450.

[14] 薛光榮，楊振英，朱秋英，等.草莓花藥培養(yǎng)獲得無病毒植株的技術研究[J].植物學通報，1990，7（1）：22-26.

[15] 王永柱，阮利民，呂鵬飛.草莓脫毒組培苗特性及栽培技術探討[J].浙江農業(yè)科學，2012（5）：664-666.

[16] 大澤勝次.用花藥培養(yǎng)脫毒苗的研究[J].農業(yè)與園藝，1974（4）：537-540.

[17] 任建宏，王占明，劉晶，等.草莓“拉松7號”花藥培養(yǎng)研究[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（5）：2250-2253.

[18] 杭玲，蘇國秀，陳麗娟，等.草莓花藥培養(yǎng)再生植株研究[J].廣西農業(yè)科學，1999（5）：227-229.

[19] 龍照春，郭春華，高慶玉，等.寒地草莓幾種脫毒技術比較研究[J].中國林副特產，2014（4）：61-62.

[20] 陳玉波，張學明，姚環(huán)宇，等.以草莓花藥培養(yǎng)實現脫毒的研究進展[J].北方果樹，2016（6）：1-3.

[21] Johansson LB. Effects of activated charcoal， cold treatment and elevated CO2 concentrations on embryogenesis in anther cultures[J]. Acta Horticulturae， 1986， 223：452-456.

[22] 晁慧娟，劉敏，姬謙龍，等.甜查理草莓花藥培養(yǎng)脫毒技術[J].北京農學院學報，2010，25 （2）：18-21.

[23] 王際軒.草莓的病毒病及無病毒苗繁殖[J].北方果樹，2011（2）：44-47.

[24] 劉健，劉向蕾，胡繁榮，等.草莓熱處理結合莖尖培養(yǎng)脫毒效果的研究[J].浙江農業(yè)科學，2009（6）：1088-1090.

[25] 李志強，王晶，丁國亮，等.草莓熱處理結合莖尖脫毒技術研究[J].北方園藝，2012（5）：125-127.

[26] 陳英，肖春林，羅燕娜，等.紅顏草莓脫毒優(yōu)化及病毒檢測的研究[J].浙江農業(yè)學報，2017，29（6）：966-970.

[27] 魏永祥.草莓無病毒栽培技術[M].北京：金盾出版社，2007.

[28] 趙海紅.二次莖尖脫毒法對草莓莖尖培養(yǎng)及脫毒效果的影響[J].黑龍江農業(yè)科學，2015（5）：15-17.

[29] Zhao L， Wang MR， Cui ZH， et al. Combining thermotherapy with cryotherapy for efficient eradication of apple stem grooving virus from infected In-vitro-cultured apple shoots[J]. Plant disease，2018，102（8）：1574-1580.

[30] QC Wang， Jari PT Valkonen. Cryotherapy of shoot tips： novel pathogen eradication method[J]. Techniques & Applications， 2009，14（3）：119-122.

[31] Feng CH， Wang RR， Li JW. Production of pathogen-free horticultural crops by cryotherapy of In vitro-grown shoot tips[J]. Protocols for Micropropagation of selected， 2013， 110（13）：463-482.

[32] Feng CH， Yin ZY， Ma YL. Cryopreservation of sweet potato （Ipomoea batatas） and its pathogen eradication by cryotherapy[J]. Biotechnology Advances， 2011，29（1）：84-93.

[33] 盛宏亞，萬繼花，徐川，等.利用玻璃化超低溫技術脫除草莓斑駁病毒（SWoV）的初步研究[J].中國農業(yè)大學學報，2016，21（3）：53-57.

[34] 蔡斌華，張計育，渠慎春，等.通過玻璃化超低溫處理脫除草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）研究[J].果樹學報，2008，25（6）：872-876.

[35] 羅婭，邱靜，凌亞杰，等.超低溫療法在草莓病毒脫除中的應用[J].分子植物育種，2016，14（9）：2488-2494.

[36] 朱文濤，周厚成，王子成.五葉草莓超低溫保存及遺傳穩(wěn)定性分析[J].果樹學報，2013，30（1）：55-61.

[37] Müller J， Day JG， Harding K， et al. Assessing genetic stability of a range of terrestrial microalgae after cryopreservation using amplified fragment length polymorphism （AFLP）[J]. Am J Bot， 2007， 94（5）：799-808.

[38] Katchen Julliany P. Silva， Asha Brunings， Natalia A. Peres， et al. The Arabidopsis NPR1 gene confers broad-spectrum disease resistance in strawberry[J]. Transgenic Research， 2015， 24（4）：693-704.

（責任編輯：易 ?婧）