軍醫(yī)大學本科生鼻腔定植金黃色葡萄球菌和其他可培養(yǎng)菌群的篩查

李 強，周 柯，孫 菲

(1. 空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院學員五大隊十九隊，陜西 西安 710032； 2. 空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院檢驗科 全軍臨床檢驗醫(yī)學研究所，陜西 西安 710032； 3. 空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，陜西 西安 710032)

鼻腔共生菌群是人體正常菌群的一部分，在維持宿主正常生理功能中具有重要作用，但此類菌群在特定情況下可轉(zhuǎn)化為機會致病菌引發(fā)機體感染[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是一種對人類致病的革蘭陽性球菌，具有多種毒力因子，是引起社區(qū)和醫(yī)院感染的重要病原菌。SA可長期或間斷定植在部分人群的鼻前庭(前鼻孔)內(nèi)，與其他鼻腔微生物一并構(gòu)成鼻腔共生菌群，可轉(zhuǎn)化為機會致病菌并引發(fā)機體感染。當鼻腔定植的SA轉(zhuǎn)移到皮膚或身體其他部位，可引起皮膚軟組織、手術(shù)切口、呼吸道、骨關(guān)節(jié)、血流等感染[2-3]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是重要的醫(yī)院感染多重耐藥菌，所致感染常難以治療，且在社區(qū)和醫(yī)療機構(gòu)人群的分離率有逐漸升高趨勢。開展特定人群鼻腔定植SA和其他條件致病菌的篩查，對于預(yù)防潛在的SA感染，其他條件致病菌所致的感染和醫(yī)院感染都具有重要意義。

本研究通過植絨轉(zhuǎn)運拭子對在某院進行臨床醫(yī)學課程學習的161名健康本科生進行鼻前庭標本采集，通過微生物自動化系統(tǒng)接種于各類細菌培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)和菌落觀察，并通過細菌鑒定從而確定鼻腔SA和其他可培養(yǎng)共生菌的定植情況，通過抗菌藥物敏感性試驗檢測SA耐藥表型，為鼻腔定植條件致病菌特別是SA的快速篩查及其感染控制提供新的方法和理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年2—3月在空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院進行臨床醫(yī)學課程學習的2016級臨床醫(yī)學、心理學、預(yù)防醫(yī)學和口腔醫(yī)學專業(yè)本科學員。所選對象均為健康青年人群，并對有下列情況之一者予以排除：(1)近1個月內(nèi)使用抗菌藥物；(2)近1個月內(nèi)患急、慢性呼吸系統(tǒng)疾??；(3)上頜竇漏、牙源性鼻竇炎或真菌性變應(yīng)性鼻竇炎者。項目通過醫(yī)院倫理委員會批準(KY20193286)。

1.2 材料與設(shè)備 eSwab含轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基植絨拭子(簡稱為植絨轉(zhuǎn)運拭子)、WaspLab微生物自動化系統(tǒng)購于意大利Copan，羊血瓊脂培養(yǎng)基、含萬古霉素巧克力瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白(MH)藥敏瓊脂培養(yǎng)基購于鄭州安圖生物，Vitek-GP革蘭陽性菌鑒定卡片、AST-GP67革蘭陽性菌藥敏卡片、VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定藥敏儀、Vitek MS微生物質(zhì)譜鑒定儀、質(zhì)譜靶板和基質(zhì)液購于法國Biomerieux，抗菌藥物藥敏紙片購于英國Oxoid，質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、ATCC 25923購于國家微生物菌種保藏中心，Vitek MS質(zhì)譜儀質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 8739由儀器生產(chǎn)商提供。

1.3 鼻前庭樣本采集 拆開植絨轉(zhuǎn)運拭子獨立包裝，打開含轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基的保存管螺旋蓋，用eSwab植絨拭子蘸取轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基使拭子頭濕潤，將其依次插入患者雙側(cè)鼻前孔約2 cm，每個鼻孔分別以順時針和逆時針緩慢旋轉(zhuǎn)2～5次，需要注意應(yīng)輕柔擦拭鼻黏膜組織以保證采集到黏膜上皮細胞。采集完畢將植絨拭子插入轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基保存管，在植絨拭子柄中部折斷并棄去手持部分，蓋好保存管螺旋蓋，室溫下保存，24 h內(nèi)送達檢驗科微生物實驗室進行處理。

1.4 標本接種培養(yǎng)和菌落判讀 植絨轉(zhuǎn)運拭子通過手工接種或Wasp Lab微生物自動化系統(tǒng)預(yù)先設(shè)置的接種模式，分別接種于羊血、巧克力、麥康凱瓊脂，35℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)16 h和40 h進行自動培養(yǎng)基拍攝，并通過系統(tǒng)影像工作站軟件進行菌落觀察，對生長菌落進行質(zhì)譜鑒定，并根據(jù)需要進行藥敏試驗。如暫無病原菌生長，則繼續(xù)在孵箱中培養(yǎng)至40 h后自動進行第二次拍攝和菌落觀察，防止漏檢。

1.5 細菌鑒定 采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)進行菌株鑒定。根據(jù)Vitek MS檢測標準操作規(guī)程，用一次性1 μL接種環(huán)挑取單個待測菌落，均勻涂布在靶板檢測點上制成厚度適中的菌膜，用微量移液器吸取1 μL基質(zhì)液覆蓋于菌膜之上。將ATCC 8739質(zhì)控菌株菌落涂布于靶板質(zhì)控點，待所有菌膜基質(zhì)液干燥后，靶板裝載入Vitek MS進行鑒定，獲得待測菌落質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

1.6 藥敏試驗 執(zhí)行自動化儀器法藥敏試驗檢測分離的SA菌株的耐藥表型，以一次性棉拭子挑取足量疑似SA菌落，無菌生理鹽水配置0.5麥氏單位菌懸液，用AST-GP67革蘭陽性菌藥敏卡片通過VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定藥敏儀進行藥敏試驗。藥敏結(jié)果依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)藥敏試驗2018年 M100-28th標準判斷結(jié)果，其中苯唑西林最低抑菌濃度(MIC)≥4 μg/mL時判斷為MRSA，苯唑西林MIC≤2 μg/mL為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)。

2 結(jié)果

2.1 鼻腔定植菌檢出情況 共采集161名健康軍校本科生的鼻前庭標本，其中男性140名，女性21名，年齡20～22歲。檢出可培養(yǎng)定植細菌549株，未檢出真菌。其中革蘭陽性菌493株，居前三位的菌為擁擠棒狀桿菌(151株)、表皮葡萄球菌(150株)、假白喉棒狀桿菌(54株)，檢出金黃色葡萄球菌41株(鼻腔SA定植率為25.46%)；革蘭陰性菌56株，居前三位的菌為肺炎克雷伯菌(13株)、產(chǎn)氣腸桿菌(13株)、莫拉菌屬(12株)。見表1。鼻前庭標本同時分離的細菌種類2～6種不等，共有72種不同的帶菌模式，以同時檢出金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和擁擠棒狀桿菌帶菌模式的學員最多，達21名(13.04%)。鼻前庭常見的五種定植菌模式見表2，鼻腔定植菌在血培養(yǎng)基上生長情況見圖1。

表1軍醫(yī)大學本科生鼻腔定植菌檢出情況

Table1Detection result of nasal colonized bacteria of military medical university students

細菌名稱檢出株數(shù)構(gòu)成比(%)革蘭陽性菌49389.80 金黃色葡萄球菌 41 7.47 表皮葡萄球菌15027.32 溶血葡萄球菌 8 1.46 科氏葡萄球菌 4 0.73 頭狀葡萄球菌 4 0.73 擁擠棒狀桿菌151 27.51 假白喉棒狀桿菌 54 9.84 懶惰狡詐球菌 38 6.92 蠟樣芽孢桿菌 32 5.83 短芽孢桿菌 1 0.18 藤黃微球菌 2 0.36 里拉微球菌 1 0.18 肺炎鏈球菌 1 0.18 緩癥鏈球菌 4 0.73 微黃奈瑟菌 2 0.36 革蘭陰性菌 56 10.20 大腸埃希菌 2 0.36 肺炎克雷伯菌 13 2.37 產(chǎn)氣腸桿菌 13 2.37 產(chǎn)酸克雷伯菌 2 0.36 黏質(zhì)沙雷菌 3 0.55 陰溝腸桿菌 2 0.36 克氏檸檬酸桿菌 1 0.18 弗勞地檸檬酸桿菌 3 0.55 烏克曼檸檬酸桿菌 1 0.18 銅綠假單胞菌 1 0.18 流感嗜血桿菌 2 0.36 副流感嗜血桿菌 1 0.18 非液化莫拉菌 8 1.46 腔隙莫拉菌 1 0.18 奧斯陸莫拉菌 3 0.55 合計549100.00

表2軍醫(yī)大學本科生鼻前庭常見的五種定植菌模式

Table2Five common patterns of colonized bacteria in nasal vestibule of military medical university students

定植菌模式檢出人數(shù)構(gòu)成比(%)表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+金黃色葡萄球菌2113.04 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌1911.80 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+假白喉棒狀桿菌 9 5.59 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+假白喉棒狀桿菌+懶惰狡詐球菌95.59 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+蠟樣芽孢桿菌 8 4.97

A：經(jīng)鑒定為凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌和狡詐球菌菌落； B：經(jīng)鑒定為金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和棒狀桿菌菌落； C：經(jīng)鑒定為凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌和腸桿菌科細菌菌落；拍攝時間均為培養(yǎng)40 h

圖1軍醫(yī)大學本科生鼻腔定植菌在血培養(yǎng)基上生長情況

Figure1Growth of nasal colonized bacteria on blood culture medium of military medical university students

表341株軍醫(yī)大學本科生鼻腔定植SA對抗菌藥物的耐藥情況

Table3Antimicrobial resistance of 41 strains of nasal colonized SA of military medical university students

抗菌藥物耐藥株數(shù)耐藥率(%)青霉素3278.05 苯唑西林717.07 慶大霉素 3 7.32 萬古霉素00.00 替考拉寧 0 0.00 利奈唑胺00.00 四環(huán)素 2 4.88 多西環(huán)素00.00 紅霉素1741.46 替加環(huán)素 00.00 克林霉素1639.02 左氧氟沙星 24.88 復(fù)方磺胺甲口惡唑 4 9.76 利福平00.00

3 討論

SA屬于葡萄球菌屬，是引起人類和動物疾病的重要病原菌，常分布在哺乳動物鼻前庭、皮膚和黏膜中，約有50%人群長期或間斷攜帶。SA可產(chǎn)生多種毒力因子，如黏附素、酶和毒素，以逃避宿主的免疫反應(yīng)。鼻前庭定植的SA可以轉(zhuǎn)移到皮膚或身體其他部位，引發(fā)毒素性疾病和化膿性感染等，因此，鼻腔定植的SA可能在其感染入侵時扮演了關(guān)鍵角色[3]。SA是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，主要引起皮膚軟組織感染、手術(shù)切口感染、醫(yī)院獲得性肺炎等。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)醫(yī)務(wù)人員、胰島素依賴型糖尿病患者、長期接受血液透析患者、非法靜脈用藥患者鼻腔SA攜帶率高于正常人群。MRSA是指含有mecA基因或者抗菌藥物敏感性試驗中苯唑西林MIC≥4 μg/mL的SA菌株，對除頭孢洛林以外的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥以外，常對大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥，已成為重要的醫(yī)院感染多重耐藥菌，其所致感染更加難以治療[2]。國外醫(yī)療機構(gòu)已常規(guī)開展住院患者鼻腔MRSA定植篩查和去定植干預(yù)，對于醫(yī)院感染控制具有重要意義。在我國，對正常健康人群和醫(yī)務(wù)人員鼻腔SA和MRSA的定植率未開展大規(guī)模調(diào)查。本研究中161名健康軍醫(yī)大學本科生共檢出鼻腔可培養(yǎng)定植菌549株，其中包括41株SA，鼻腔SA定植率為25.46%，耐藥表型檢測提示鼻腔MRSA定植率為4.35%，接近于陳南菊等[7]報道的大學生鼻腔SA的定植率(26.24%)，高于劉軍(SA 10%)[8]、張亞莉(SA 16.1%)[9]和董宏亮(SA 5.16%，MRSA 1.72%)等[10]報道的臨床醫(yī)務(wù)人員鼻腔SA的定植率。開展醫(yī)務(wù)人員、易感患者鼻腔定植SA和MRSA的快速篩查和干預(yù)，可為SA感染防治及其醫(yī)院感染防控提供新的技術(shù)手段。

基于人類微生物組的研究提示，健康人鼻前庭含有鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、莫拉菌、奈瑟菌、嗜血桿菌屬等鼻腔共生菌[3]，是人體正常菌群的一部分，在維持宿主正常生理和免疫功能中發(fā)揮重要作用，能抑制病原體入侵和增殖。但在宿主免疫力低下、鼻腔共生菌群失衡時，可成為致病菌和耐藥菌的儲存庫，可轉(zhuǎn)化為機會/條件致病菌并引發(fā)機體感染[1]。本研究中健康大學生分離的鼻前庭共生菌群中，葡萄球菌、棒狀桿菌和狡詐菌屬的分離率較高。其中凝固酶陰性葡萄球菌如表皮葡萄球菌等，近年來逐漸被公認為醫(yī)院感染病原菌，是導(dǎo)管相關(guān)血流感染、人工心臟瓣膜或血管植入、假體植入、腦脊液分流相關(guān)感染最常見病原體[3, 11]。擁擠棒狀桿菌是人體眼、耳、鼻和口咽部正常菌群，在臨床可引起主動脈和二尖瓣心內(nèi)膜炎等感染[3]。假白喉棒狀桿菌是口咽微生物的一部分，有引起肺炎的臨床報道[3]。懶惰狡詐球菌可從呼吸道、眼和血標本中分離，與醫(yī)院獲得性肺炎、敗血癥、急性膽囊炎伴胰腺炎、角膜炎、滑膜炎以及生物材料相關(guān)關(guān)節(jié)炎等感染性疾病相關(guān)[3, 12]。值得一提的是，凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌(不包括肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌)、棒狀桿菌(不包括白喉棒狀桿菌)、狡詐球菌、芽孢桿菌、微球菌、奈瑟菌(不包括腦膜炎奈瑟菌)、莫拉菌屬(不包括卡他莫拉菌)等，對于免疫功能正常者致病力較弱，可認定為正常菌群[13]。而肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌可引起社區(qū)獲得性上呼吸道感染，認為其屬于重要機會性致病菌。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌本身的致病力和毒力較強，可在一定意義上歸屬于致病菌或機會性致病菌。埃希菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬、檸檬酸桿菌屬屬于腸桿菌科細菌，在健康人群鼻腔的定植率較低，屬于機會性致病菌，在老年人群、住院患者鼻腔分離率會相對增高，是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，有造成全身多系統(tǒng)感染的風險，其多重耐藥菌株所致感染常難以治療。盡管可培養(yǎng)細菌數(shù)量繁雜，但仍然有大部分菌群無法在體外培養(yǎng)，包括鼻腔后部定植的厭氧微生物，如丙酸桿菌屬。本研究中，軍醫(yī)大學本科生鼻腔定植菌在構(gòu)成上保持了天然的正常菌群多樣性，與相關(guān)報道[8, 14-16]對醫(yī)務(wù)人員鼻腔定植菌的調(diào)查有所差異，而后者多為葡萄球菌屬、腸桿菌科細菌和非發(fā)酵菌等致病菌或多重耐藥菌，失去了菌群多樣性。

鼻腔共生菌群具有造成人體自身機會性感染的風險，而醫(yī)務(wù)人員鼻腔定植菌極易通過醫(yī)療操作交叉?zhèn)鞑ザ鸹颊哚t(yī)院獲得性感染。開展醫(yī)務(wù)人員、易感患者鼻腔定植菌的篩查、干預(yù)措施的研究，不但有助于自身感染性疾病的預(yù)防和治療，而且對于醫(yī)院感染的防控具有重要意義。研究[17]證實，約三分之一的醫(yī)院感染都可直接或間接因醫(yī)務(wù)人員經(jīng)手傳播的細菌造成。手衛(wèi)生是預(yù)防和控制醫(yī)院感染最簡單、有效、方便和經(jīng)濟的方法[18]，可顯著降低醫(yī)療機構(gòu)中肺炎克雷伯菌和MRSA的傳播，降低醫(yī)院感染發(fā)生[19]。結(jié)合細菌培養(yǎng)的結(jié)果，我們對臨床醫(yī)學本科生也進行了手衛(wèi)生等醫(yī)院感染控制措施的教育培訓，有效地培養(yǎng)手衛(wèi)生習慣和對醫(yī)院感染防控的認識。軍醫(yī)大學本科生作為軍隊和地方醫(yī)院醫(yī)務(wù)工作者的預(yù)備人才，樹立良好的醫(yī)療衛(wèi)生行為和感染控制意識對于醫(yī)院感染防控以及平戰(zhàn)時感染性疾病的防治具有戰(zhàn)略作用。