化學(xué)合成多肽體外抗HBV復(fù)制的研究

王曉芳，范學(xué)工，黃澤炳，黃 燕，陳若嬋，易盼盼，李 寧，胡興旺

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染病科/病毒性肝炎湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410008)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一個重要的公共衛(wèi)生問題。全世界約三分之一的人既往或現(xiàn)癥感染HBV，慢性HBV攜帶者約3.5億～4億[1]。HBV感染慢性化后需要長期服抗病毒藥物，往往發(fā)展為肝硬化，甚至肝細胞癌。HBV表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg)血清清除及HBV-DNA復(fù)制抑制是治療HBV感染最重要的臨床觀察指標(biāo)，也是慢性乙型肝炎治療的主要目標(biāo)。血清HBsAg是肝炎病毒感染的生物學(xué)標(biāo)記，HBeAg陽性表示患者處于高感染低應(yīng)答期，而HBV-DNA拷貝量被認(rèn)為是HBV復(fù)制活躍的標(biāo)志，這三個指標(biāo)常用來衡量HBV感染的情況。目前，臨床治療乙型肝炎的抗病毒藥物主要有干擾素、核苷(酸)類似物等。由于慢性HBV感染難根治，上述藥物治療需長期使用，致病毒耐藥性逐年增加，且存在多種副作用。因此臨床一線抗病毒藥物的選擇要求藥物具有低耐藥率和高病毒抑制率。新型抗HBV藥物成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注點之一。

二十世紀(jì)八十年代以來，抗微生物肽(antimicrobial peptides, AMPs)也稱抗菌肽，因其對感染性微生物具有抑制作用而備受關(guān)注，被認(rèn)為是最有希望的抗生素替代物[2-3]。隨著人們對抗菌肽研究的深入，其抗病毒作用也不斷被挖掘，可通過多種機制阻止病毒感染的過程，如皰疹病毒、肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)等都具有包膜結(jié)構(gòu)，抗菌肽通過結(jié)合病毒表面包膜并使其穿孔，從而影響病毒的繁殖、組裝和釋放。根據(jù)目前HBV感染及治療的難點，結(jié)合現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽抗病毒作用，筆者模擬天然抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計并合成了一系列化學(xué)合成多肽，在體外測試化學(xué)合成多肽抗HBV作用，研究不僅證明了多肽抗HBV的可行性和有效性，也為未來尋找新的HBV臨床治療藥物提供思路，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HepG 2.2.15細胞系購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細胞庫，該細胞株為重組載體pDoLT-HBV-1轉(zhuǎn)染后的HepG 2細胞，可穩(wěn)定分泌病毒顆粒和病毒蛋白[4-5]，廣泛應(yīng)用于HBV復(fù)制相關(guān)研究。本研究所用多肽由湖南師范大學(xué)生命與科學(xué)學(xué)院容明強教授友情提供。采用傳統(tǒng)的甲基丙烯酸聚合物平臺設(shè)計7種化學(xué)合成多肽。在傳甲基丙烯酸聚合物基礎(chǔ)上設(shè)計聚合物，合成側(cè)鏈上帶有陽離子和疏水基團的甲基丙烯酸酯，側(cè)鏈基團隨機分布在聚合物鏈中。天然存在及既往設(shè)計的抗菌肽序列中，存在豐富的賴氨酸殘基，其可發(fā)揮陽離子官能團作用，通過靜電引力增強抗菌肽與細菌表面的結(jié)合。因此，本研究設(shè)計的無規(guī)共聚物以伯銨基團作為陽離子來源，模擬賴氨酸殘基的陽離子功能。同時為了探索凈陽離子電荷和疏水性之間的平衡，疏水基團(MPHB)的摩爾百分比(基團/陽離子多聚物)從0到60%變化?；谝陨显瓌t設(shè)計了7種多肽，并以固相法合成。序列見表1。陽性對照藥物拉米夫定購自Sigma公司(Sigma PHR1365)，HBsAg檢測試劑盒 (ARCHITECT Anti-HBs Reagent Kit)和HBeAg檢測試劑盒(ARCHITECT Anti-HBe Reagent Kit)購自雅培制藥有限公司。HBV核酸定量檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。

1.2 實驗方法 將7種化學(xué)合成多肽(10 mg/mL)、拉米夫定(1 mg/mL，陽性對照)、空白溶劑(陰性對照)作用于HepG 2.2.15細胞系，檢測化學(xué)合成多肽對HBV的抑制作用。

表17種化學(xué)合成多肽及序列

Table1Seven chemically synthesized polypeptides and their sequences

化學(xué)合成多肽序列KBDT-1CKRWKKWWRKWKKWC(兩個C形成一個分子內(nèi)二硫鍵)pI/Mw: 10.67/2236.78KBDT-2VKRWKKWWRKWKKWF-NH2(C-末端酰胺化)pI/Mw: 12.05/2276.81KBDT-3VKRWKKWFRKWKKWW-NH2(C-末端酰胺化)pI/Mw: 12.05/2276.81KBDT-4VKRWKKFWRKWKKWW-NH2(C-末端酰胺化)pI/Mw: 12.05/2276.81KBDT-5VKRWKKWFRKWKKWV-NH2(C-末端酰胺化)pI/Mw: 12.05/2189.73KBDT-6VKRWKKFWRKWKKWV-NH2(C-末端酰胺化)pI/Mw: 12.05/2189.73KBDT-7VKWRWKWKWRWKWKWKV-NH2(C-末端酰胺化)pI/Mw: 12.05/2601.19

1.2.1 HBV-DNA滴度測定 使用HBV核酸定量檢測試劑盒對HBV-DNA進行檢測。該試劑盒基于磁珠法，提取細胞上清液中的HBV-DNA，使用Taq-Man熒光探針法，在病毒核酸序列中相對保守區(qū)設(shè)計兩條特異性引物、一條特異熒光探針，通過實時熒光定量PCR法(RT-PCR)，于藥物處理后第2、4天檢測HBV-DNA?？紤]到多肽可能受細胞吸收、降解等因素影響，挑選對HBV-DNA復(fù)制有抑制作用的多肽，將細胞處理時間延長至6 d及9 d以檢測其抗病毒作用的穩(wěn)定性。

1.2.2 HBsAg及HBeAg測定 為明確化學(xué)合成多肽能否對HBsAg及HBeAg產(chǎn)生抑制作用，使用雅培制藥有限公司HBsAg和HBeAg檢測試劑盒，檢測HepG 2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg及HBeAg情況(藥物處理后第2、4天)。該試劑盒基于化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測技術(shù)，通過將樣品與試劑中包被有HBs/HBe抗體的順磁微粒子孵育，沖洗后加入吖啶脂標(biāo)記，再次沖洗后依次加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，定量測量化學(xué)發(fā)光強弱，計算HBsAg和HBeAg含量。全檢測流程在Abbott i2000SR儀器(雅培)中自動完成。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法檢測細胞存活率 為觀察化學(xué)合成多肽對細胞狀態(tài)的影響，在藥物培養(yǎng)過程中采用光鏡觀察細胞形態(tài)變化。同時在藥物處理至9 d后，采用結(jié)晶紫染色法檢測其細胞毒性作用。結(jié)晶紫可被活細胞攝取并將細胞核染成深紫色，而死亡細胞幾乎不與結(jié)晶紫試劑結(jié)合，用于細胞存活檢測。細胞在37℃培養(yǎng)并藥物處理后，吸去上清培養(yǎng)基，PBS清洗后加入結(jié)晶紫染色液(碧云天生物技術(shù)有限公司，C0121)染色，隨后棄去染色液，雙蒸水充分洗滌游離染色劑，晾干后加入1% SDS溶液洗脫溶解。取100 μL于Perkinelmer EnSight多功能酶標(biāo)儀中檢測570 nm吸光OD值。

1.2.4 不同濃度的化學(xué)合成多肽抗HBV復(fù)制的影響 為明確不同濃度的化學(xué)合成多肽對HBV-DNA復(fù)制抑制的作用，選取了HBV抑制作用最強的多肽，設(shè)置10、1、0.1 mg/mL濃度梯度，分別處理HepG 2.2.15細胞3、6、9 d后，收集細胞上清液，采用RT-PCR檢測病毒DNA拷貝量，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測HBsAg及HBeAg的變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Prism Graphpad 5.0和SPSS 22軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理，各數(shù)據(jù)組采用t-test，Dunnet-t test，單因素重復(fù)測量方差分析等方法進行統(tǒng)計分析，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

HBV-DNA抑制率(%)=

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)合成多肽對HBV的抑制作用

2.1.1 化學(xué)合成多肽抑制HBV-DNA復(fù)制 采用RT-PCR法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBV-DNA拷貝量的變化。藥物處理2 d時，各組藥物、拉米夫定對HBV-DNA復(fù)制無明顯抑制效果；藥物處理4 d后，KBDT-2、5對HBV-DNA的抑制效果與拉米夫定類似，其余各組無明顯抑制效果。見圖1。

2.1.2 化學(xué)合成多肽抑制HBsAg及HBeAg表達 分別使用7種化學(xué)合成多肽、拉米夫定(陽性對照)或空白溶劑(陰性對照)處理HepG 2.2.15細胞，結(jié)果顯示，藥物處理2 d時，KBDT-3、6、7對HBsAg有抑制效果，KBDT-1、7對HBeAg有抑制效果，其余各組無明顯抑制效果；藥物處理4 d時，KBDT-7對HBsAg有抑制效果，KBDT-1、7對HBeAg有抑制效果，其余各組無明顯抑制效果。見圖2。

A：各藥物處理第2天HBV-DNA測定結(jié)果；B:各藥物處理第4天HBV-DNA測定結(jié)果(*：P<0.05)

A:各藥物處理2 d后HBsAg測定；B：處理2 d后HBeAg測定；C:各藥物處理4 d后HBsAg測定；D:處理4 d后HBeAg測定。*：P<0.05 ；**：P<0.01，n=3

圖2化學(xué)合成多肽對HBsAg及HBeAg的影響

Figure2Effect of chemically synthesized polypeptides on HBsAg and HBeAg

2.1.3 化學(xué)合成多肽對細胞狀態(tài)的影響 藥物處理4 d后，鏡下可見KBDT-7處理組HepG 2.2.15細胞數(shù)量明顯減少，大片脫落，細胞變圓且透亮，細胞大片死亡，顯示KBDT-7對細胞毒性較大。其他6種多肽、陽性對照拉米夫定及陰性對照未見明顯HepG 2.2.15細胞死亡及細胞形態(tài)變化。 見圖3。

注：A～G分別為KBDT-1～7,H為拉米夫定組，I為空白溶劑處理組

2.2 化學(xué)合成多肽KBDT-2、5具有穩(wěn)定的抗HBV作用

2.2.1 化學(xué)合成多肽可穩(wěn)定抑制HBV-DNA復(fù)制 上述實驗證實，化學(xué)合成多肽KBDT-2、5可有效抑制HBV-DNA復(fù)制，將細胞處理時間延長至6 d及9 d以檢測其抗病毒作用的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，處理6 d及9 d，KBDT-2、5、拉米夫定仍對HBV-DNA復(fù)制有良好抑制效果。見圖4。

A：藥物處理6 d時HBV-DNA測定；B:藥物處理9 d時HBV-DNA測定；*：P<0.05 ；**：P<0.01

2.2.2 化學(xué)合成多肽長時間處理不影響細胞存活 將多肽KBDT-2、5處理HepG 2.2.15細胞時間延長至9 d，采用結(jié)晶紫染色法檢測其細胞毒性作用，結(jié)果顯示處理9 d后，與空白對照比較，KBDT-2、5及拉米夫定對HepG 2.2.15無明顯細胞毒性作用(P>0.05)。見圖5。

圖5多肽KBDT-2、5處理HepG 2.2.15細胞9 d后結(jié)晶紫法檢測細胞存活(OD=570 nm，n=3)

Figure5Cell viability detected by crystal violet staining after HepG 2.2.15 cells were treated with KBDT-2 and 5 for 9 days(OD=570 nm,n=3)

2.3 化學(xué)合成多肽KBDT-2對HBV抑制作用呈濃度梯度依賴

2.3.1 不同濃度的KBDT-2對HBV-DNA的抑制作用 為明確不同濃度的化學(xué)合成多肽對HBV-DNA復(fù)制抑制的作用，選取HBV抑制作用最強的多肽KBDT-2，設(shè)置10、1、0.1 mg/mL濃度梯度，分別處理HepG 2.2.15細胞3、6、9 d后，收集細胞上清液，采用RT-PCR檢測病毒DNA拷貝量。結(jié)果顯示藥物處理后，10 mg/mL KBDT-2、拉米夫定對HBV-DNA復(fù)制有抑制效果；比較10 mg/mL的KBDT-2處理3、6、9 d HBV-DNA抑制率分別為36.0%、51.5%、56.3%，抑制效果在第6天達到高峰，單因素重復(fù)測量方差分析顯示，延長處理9 d后仍然維持較高抑制率，不隨時間延長繼續(xù)升高(F=1.240，P=0.381)。其余各組對HBV-DNA復(fù)制無明顯抑制效果。見圖6。

2.3.2 不同濃度化學(xué)合成多肽KBDT-2對HBsAg及HBeAg的作用 為明確不同濃度的KBDT-2對HBsAg及HBeAg的作用，同樣處理后收集細胞上清液，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測HBsAg及HBeAg的變化,KBDT-2處理9 d時，10 mg/mL KBDT-2對HBsAg、HBeAg有抑制效果，其余各組無明顯抑制效果。見圖7。

A：藥物處理第3天時HBV-DNA測定；B:藥物處理第6天時HBV-DNA測定；C：藥物處理第9天時HBV-DNA測定(Dunnet-t test，*：P<0.05;**：P<0.01 )

圖6不同濃度梯度的KBDT-2對HBV-DNA復(fù)制影響

Figure6Effect of different concentration gradients of KBDT-2 on HBV-DNA replication

2.3.3 不同濃度的化學(xué)合成多肽KBDT-2對細胞存活的影響 采用結(jié)晶紫染色法檢測不同濃度的化學(xué)合成多肽KBDT-2對細胞毒性作用，結(jié)果顯示，處理9 d后，各濃度的KBDT-2及拉米夫定對HepG 2.2.15無明顯毒性作用，見圖8。KBDT-2(10、1、0.1 mg/mL)、拉米夫定以及空白溶劑處理HepG 2.2.15細胞9 d后，結(jié)晶紫法檢測細胞存活相比，各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A:藥物處理9 d后HBsAg測定；B:藥物處理9 d后HBeAg測定 (*：P<0.05，n=3)

圖8不同濃度KBDT-2處理HepG 2.2.15細胞9 d后結(jié)晶紫法檢測細胞存活(OD=570 nm，n=3)

Figure8Cell viability detected by crystal violet staining after HepG 2.2.15 cells were treated with different concentrations of KBDT-2 for 9 days(OD=570 nm,n=3)

3 討論

HBV是一種嚴(yán)重威脅世界各國人民健康的傳染病，宿主細胞中長期的HBV活動，激活多種信號傳導(dǎo)通路及激酶，如NF-κB、PI3K-Akt、SAPK/JNK、Jak1-STAT、MAPK[6]，激活促癌基因[7]，抑制抑癌基因[8], 改變細胞遺傳學(xué)[9]和表觀遺傳學(xué)性狀[10]等多種途徑，導(dǎo)致肝細胞癌的發(fā)生[11-12]，因此，有效控制慢性HBV復(fù)制是控制慢性乙肝病情進展、惡化的關(guān)鍵因素。

目前，臨床主要抗病毒藥物包括干擾素與核苷類似物。由于慢性HBV感染難根治，上述藥物治療需長期使用，存在不良反應(yīng)及副作用，病毒耐藥，停藥后復(fù)發(fā)等不足[13]。研發(fā)新型、高效的抗HBV藥物可以豐富抗HBV的“武器庫”，對促進HBV感染的治療具有積極作用。

抗菌肽廣泛存在于自然界各種微生物、植物和動物(無脊椎動物和脊椎動物)中，具有抑制和殺滅細菌、真菌、包膜病毒等多種微生物的作用?？咕淖鳛闈撛诘摹靶滦涂股亍保哂性S多天然的優(yōu)點，如相對較小的分子量(小于25 kDa～30 kDa)、兩親性結(jié)構(gòu)(親水親脂)、帶電陽離子電荷等，有利于其結(jié)合并作用于微生物；同時由于其天然存在于人體內(nèi)，因此，對真核細胞殺傷作用小，副作用少，產(chǎn)生微生物耐藥性的可能性較低。近期研究發(fā)現(xiàn)，通過模擬天然存在的抗菌肽,設(shè)計并合成的化學(xué)類似物，在體外測試中展現(xiàn)出抗微生物的活性。如樹枝狀聚合物是基于丙烯酸酯單體的超分枝聚合物[14-15]，在克服收率低和純化難問題的同時，其高分子量和多價結(jié)合的特性可通過空間屏蔽或競爭性抑制，干擾病毒-宿主細胞相互作用，從而產(chǎn)生抗病毒活性[16]。另如基孔肯雅病毒(CHIKV，基孔肯雅熱的病原體)正鏈RNA轉(zhuǎn)錄翻譯的nsP2蛋白酶對病毒復(fù)制至關(guān)重要。通過電腦設(shè)計針對nsP2蛋白酶結(jié)構(gòu)的多肽，從而抑制nsP2的活性，抑制CHIKV復(fù)制[17]。因此，設(shè)計并合成的破壞病毒結(jié)構(gòu)或抑制關(guān)鍵酶類活性的多肽，可干擾病毒復(fù)制或感染過程，從而達到抗病毒的目的?？咕牡某霈F(xiàn)為病毒感染治療提供了新的選擇[18]。最新研究[19]表明，哺乳動物、植物、昆蟲甚至化學(xué)合成來源的抗菌肽，可對HIV、皰疹病毒等產(chǎn)生抑制作用。與目前的抗病毒藥物相比，這類多肽具有低耐藥性、快速起效、限制感染擴散等優(yōu)點[20]，因此，本研究探索化學(xué)合成多肽對HBV復(fù)制抑制作用，可為慢性乙肝治療提供新思路。

本研究利用傳統(tǒng)的甲基丙烯酸聚合物平臺設(shè)計7種化學(xué)合成多肽，將7種化學(xué)合成多肽作用于HepG 2.2.15細胞系，研究結(jié)果顯示，化學(xué)合成多肽KBDT-2具有體外抗HBV-DNA復(fù)制作用,呈劑量依賴。首先，KBDT-2可抑制HBsAg、HBeAg病毒基因表達，但變化時間晚于HBV-DNA降低。推測這種趨勢可能是由于病毒DNA復(fù)制受抑制后，HBsAg、HBeAg轉(zhuǎn)錄或翻譯過程滯后導(dǎo)致的抑制作用延遲。其次，KBDT-7雖然對HBV-DNA等檢測指標(biāo)具有較強抑制作用，但伴隨著大量細胞的死亡。與之形成鮮明對比的是，KBDT-2在發(fā)揮抗HBV作用的同時對HepG 2.2.15無明顯毒性，提示KBDT-2抗菌肽抗病毒作用并非通過對宿主細胞殺傷而起作用，可能通過某種未知機制作用于病毒復(fù)制過程，然而具體機制仍然有待進一步研究。根據(jù)已有報道，多肽可能通過影響DNA、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶活性，或通過影響病毒復(fù)制過程中的蛋白合成以及病毒組裝、成熟、釋放等過程而發(fā)揮抗病毒作用效果[21]；另一方面，多肽也可能依賴負電荷靜電力，與宿主細胞膜中糖胺聚糖相互作用[22]，對細胞外病毒產(chǎn)生競爭反應(yīng)，從而抑制病毒與宿主細胞膜結(jié)合；最后多肽也可結(jié)合并破壞病毒包膜，造成病毒顆粒不穩(wěn)定[23]，從而阻斷病毒的感染和復(fù)制。

本研究取得了令人鼓舞的測試結(jié)果，但仍存在不足。首先，本研究僅對化學(xué)合成多肽對病毒復(fù)制，HBV生物學(xué)標(biāo)志蛋白的作用，細胞毒性等進行了觀察研究，但對其中的分子機制深入挖掘不足。其次，本研究僅對化學(xué)合成多肽進行了小規(guī)模、小樣本的體外細胞學(xué)研究，未進行動物實驗及其他臨床實驗，在活體中的抗HBV作用效果及毒副作用有待進一步證實。最后，抗菌肽雖然展現(xiàn)了一定的抗HBV作用，但與傳統(tǒng)藥物相比，其有效性仍有待提高。值得一提是，鑒于多肽分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，化學(xué)合成多肽的抗HBV作用仍然具有較大優(yōu)化的空間。

綜上所述，本研究在分析天然抗菌肽結(jié)構(gòu)特點的基礎(chǔ)上，優(yōu)化合成了多條多肽，并測試了其抗HBV的效果，是對傳統(tǒng)意義上抗菌肽“抗細菌”作用的拓展、挖掘。同時與傳統(tǒng)抗HBV藥物相比，抗菌肽具有低耐藥率、起效快、限制病原菌擴散、中和毒素、增強抗菌作用效果等諸多優(yōu)勢，是一種從新的機制出發(fā)抑制HBV的可能途徑。因此，本研究不僅篩選出具有抑制HBV復(fù)制作用的化學(xué)合成多肽KBDT-2，也為開發(fā)新型的抗HBV藥物，改善HBV臨床耐藥提供實驗數(shù)據(jù)支持。

致謝：感謝湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院容明強教授友情設(shè)計并提供抗菌肽。