程序性細(xì)胞死亡配體1在非小細(xì)胞肺癌手術(shù)切除標(biāo)本及配對(duì)組織芯片中的表達(dá)分析*

苗茜，林根，徐海鵬，吳標(biāo)，鄭曉彬，蔣侃，力超

350014 福州，福建省腫瘤醫(yī)院·福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胸部?jī)?nèi)科(苗茜、林根、徐海鵬、吳標(biāo)、鄭曉彬、蔣侃)，病理科(力超)

免疫治療是目前肺癌治療領(lǐng)域里繼手術(shù)、化療、放療、靶向治療后新出現(xiàn)的極有潛力的新型治療方法。該方法通過(guò)使腫瘤免疫正?；瑴p少抗腫瘤的豁免，從而讓患者得到持續(xù)性的臨床獲益。程序性死亡受體1-蛋白及程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1,PD-1/PD-L1)抗體是在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中研究最多的免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑。目前，PD-1及PD-L1抗體已被批準(zhǔn)在晚期NSCLC臨床一線及二線使用。PD-L1檢測(cè)可用于預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑的優(yōu)勢(shì)人群，PD-L1表達(dá)越高，治療效果越好。Atezolizumab是針對(duì)PD-L1的人源化的IgG1單克隆抗體，目前已被批準(zhǔn)在NSCLC中一線及二線使用[1-3]。PD-L1(SP142)VENTANA法是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的針對(duì)Atezolizumab使用PD-L1補(bǔ)充診斷檢測(cè)方法。與其他PD-L1檢測(cè)方法不同，該方法除了檢測(cè)腫瘤細(xì)胞(tumor cells,TC)中PD-L1的表達(dá)情況，還檢測(cè)了免疫細(xì)胞(immune cells,IC)中PD-L1表達(dá)情況，高表達(dá)的患者(即評(píng)價(jià)≥ 50% TC或者≥ 10% IC)可能從Atezolizumab的治療中延長(zhǎng)生存[1]。我們通過(guò)檢測(cè)手術(shù)切除標(biāo)本及其配對(duì)微陳列組織標(biāo)本(tissue microarrays,TMA)的PD-L1(SP142 VENTANA法)表達(dá)情況，了解腫瘤內(nèi)PD-L1表達(dá)的一致性，并且進(jìn)一步分析PD-L1的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集及臨床資料

納入2008年10月至2010年12月在福建省腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)的NSCLC患者，收集到經(jīng)福爾馬林固定及石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本129例。術(shù)后分期根據(jù)第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Commitfee on Cancer,AJCC)TNM系統(tǒng)進(jìn)行分期，病理類型根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織肺癌診斷標(biāo)本進(jìn)行分類?；颊呔丛谑中g(shù)前接受過(guò)治療，所有患者未使用過(guò)免疫治療。

1.2 配對(duì)TMA的構(gòu)建

所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后做HE染色，病理專家作二次診斷，并在HE 切片上根據(jù)典型病理形態(tài)區(qū)域作標(biāo)記,陣列制作利用組織芯片制作儀(Beecher Instruments.Inc)在受體蠟塊(空白蠟塊)上打孔(直徑2.0mm)，然后根據(jù)HE片上精確范圍在供體組織蠟塊相應(yīng)位置獲取所要組織芯放入受體蠟塊陣列孔中，并記錄組織編號(hào)，重復(fù)上述步驟制成陣列塊4塊(共150點(diǎn))，所得的組織芯片的每個(gè)點(diǎn)都經(jīng)過(guò)病理診斷。

1.3 染色與判讀

在獲得手術(shù)標(biāo)本和配對(duì)的TMA后，將每個(gè)FFPE組織和TMA切成4μm，并使用兔單克隆抗體(克隆SP142; Ventana，Roche Group，Tucson，AZ)在自動(dòng)染色平臺(tái)上進(jìn)行免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)(Benchmark ULTRA; Ventana)，使用濃度為1:60[1]。使用OptiView DAB IHC檢測(cè)試劑盒(Ventana)和OptiViewAmplification Kit(Ventana)來(lái)顯示結(jié)合的抗PD-L1一抗; 切片用蘇木精復(fù)染。IC表達(dá)被劃分為IC0vsIC1vsIC2vsIC3，TC1/2/3或IC1/2/3定義為腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中PD-L1表達(dá)大于等于1%，TC2/3或IC2/3定義為PD-L1表達(dá)大于等于5%；TC3定義為腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)大于等于50%，而IC3定義為腫瘤微環(huán)境浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中PD-L1表達(dá)大于等于10%；TC0與IC0為PD-L1表達(dá)不到1%。總體判讀時(shí)以TC與IC高分作為判讀，如TC3分及IC0分時(shí)，總體判讀仍為3分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用于總結(jié)患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和結(jié)果。協(xié)議統(tǒng)計(jì)(Cohen的κ系數(shù))用于評(píng)估配對(duì)病變之間PD-L1表達(dá)的異質(zhì)性。一致性水平被歸類為差(≤0.4)、一般(0.40～0.75)和良好(≥0.75)。Fisher精確檢驗(yàn)用于比較組內(nèi)的比例。以P<0.05為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般臨床特征

129例患者中年齡大于60歲患者50例，占全部人群38.8%，小于60歲患者79例，占全部人群61.2%；男性88例，占全部人群68.2%，女性41例，占全部人群31.8%；既往吸煙史患者55例，占全部人群42.6%，不吸煙患者74例，占全部人群57.4%；病理鱗癌、肉瘤樣癌、腺癌及腺鱗癌分別45例、1例、70例及13例，占全部人群34.9%、0.8%、54.3%及10.1%；TNM(AJCC分期第7版)I期、II期、III期、IV期分別為28例、26例、60例及15例，占全部人群21.7%、20.2%、46.5%及11.6%(表1)。

表1 患者的一般臨床特征、病理類型及TNM分期

Table 1. General Clinical Characteristics, Pathological Types and TNM Stage of Patients

VariableNN %Age≤60y7961.2>60y5038.8

VariableNN %Sex Male8868.2Female4131.8Smoking historyNo7457.4Yes5542.6HistologySquamous cell carcinoma4534.9Sarcomatoid carcinoma10.8Adenocarcinoma7054.3Adenosquamous carcinoma1310.1TNM stageⅠ2821.7Ⅱ2620.2Ⅲ6046.5Ⅳ1511.6

2.2 手術(shù)標(biāo)本與配對(duì)TMA中PD-L1表達(dá)比較

所有的標(biāo)本中有59例(46.0%)手術(shù)標(biāo)本判讀陽(yáng)性(TC1/2/3和/或IC1/2/3)，而在相應(yīng)配對(duì)的TMA中只有31例(24.0%)判讀陽(yáng)性(TC1/2/3和/或IC1/2/3)；24例(18.7%)手術(shù)標(biāo)本判讀陽(yáng)性(TC2/3和/或IC2/3)，而在相應(yīng)配對(duì)的TMA中只有18例(14.0%)判讀陽(yáng)性(TC2/3和或IC2/3)；10例(8.7%)手術(shù)標(biāo)本判讀強(qiáng)陽(yáng)性(TC3和/或IC3)，在相應(yīng)配對(duì)的TMA中有8例(6.2%)判讀強(qiáng)陽(yáng)性(TC3和或IC3)，見(jiàn)表2和圖1(手術(shù)標(biāo)本及TMA的TC均判讀強(qiáng)陽(yáng)性)?？傮w不一致率為41.9%，k值等于0.235(一致性差)。 IC的不一致率遠(yuǎn)高于TC(39.5%vs15.5%)，k值為0.113vs0.489(一致性差與中等一致性)?？傮w陰性(TC0/IC0)顯示出中度的不一致性為49.6%，100例(77.5%)在手術(shù)標(biāo)本和配對(duì)TMA中均被認(rèn)為是TC 0，然而，只有74例(57.4%)顯示出IC0的一致性。有3例手術(shù)標(biāo)本判讀為IC3，但在配對(duì)TMA中未觀察到IC3。與低評(píng)分組(TC1/IC1)相比，可以看到高PD-L1評(píng)分組(TC3/TC2/IC3/IC2)具有更好的一致性。不同組織學(xué)亞型不一致率之間存在趨勢(shì)差異，鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carrcinoma,SCC)中TC1-3/IC1-3評(píng)分不一致率為33.3%(手術(shù)標(biāo)本為46.7%陽(yáng)性表達(dá)，配對(duì)TMA為26.7%陽(yáng)性表達(dá))，k值等于0.408；腺鱗癌(adenosquamous corr cinoma,ADC)中TC1-3 /IC1-3評(píng)分不一致率為48.5%(手術(shù)標(biāo)本為45.2%陽(yáng)性表達(dá)，配對(duì)TMA為22.6%陽(yáng)性表達(dá))，k值等于0.134(一致性差)；其他病理類型中TC1-3/IC1-3評(píng)分不一致率為為35.7%(手術(shù)標(biāo)本為57.1%陽(yáng)性表達(dá)，配對(duì)TMA為28.6%陽(yáng)性表達(dá))，k值等于0.444，詳見(jiàn)表2～4。在大部分標(biāo)本中，配對(duì)TMA較手術(shù)標(biāo)本都低評(píng)了PD-L1的表達(dá)，詳見(jiàn)圖2(手術(shù)標(biāo)本的IC判讀強(qiáng)陽(yáng)性，TMA的IC判讀陰性)。但是在少數(shù)幾個(gè)樣本中見(jiàn)到手術(shù)標(biāo)本陰性或弱陽(yáng)性而配對(duì)TMA判讀陽(yáng)性，詳見(jiàn)圖3手術(shù)標(biāo)本的TC判讀弱陽(yáng)性，TMA判讀強(qiáng)陽(yáng)性)。6例在手術(shù)標(biāo)本中判讀陰性(TC0/IC0)的標(biāo)本在配對(duì)TMA中判讀為陽(yáng)性，2例判讀為TC1，4例判讀IC1。與TC相關(guān)的不一致率為31%，而與IC相關(guān)的不一致率為69%。分析中可見(jiàn)，在手術(shù)標(biāo)本中IC陽(yáng)性率(39%)高于TC陽(yáng)性率(19%)，但是在TMA標(biāo)本中IC與TC的陽(yáng)性率都為15%，TC3與IC3的樣本并無(wú)關(guān)聯(lián)。

表2 手術(shù)標(biāo)本與配對(duì)TMA標(biāo)本最終 SP142判讀

Table 2. Final Interpretation of SP142 Stain in Surgical Specimens and Paired Tissue Microarrays

Surgical sampleChip sample-1+2+3+-1003101+273502+53333+2125

2.3 PD-L1表達(dá)與總生存曲線的關(guān)系

就總生存期而言，無(wú)論是通過(guò)手術(shù)標(biāo)本IHC染色結(jié)果來(lái)進(jìn)行判斷(圖4)，還是通過(guò)配對(duì)TMA標(biāo)本結(jié)果進(jìn)行判斷，與PD-L1表達(dá)陰性的患者相比，表達(dá)PD-L1陽(yáng)性(TC1/2/3和或IC1/2/3)的患者都沒(méi)有無(wú)優(yōu)勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(55.2 個(gè)月vs55.1 個(gè)月，P=0.624；53.5個(gè)月vs55.2 個(gè)月，P=0.833)。

表3 手術(shù)標(biāo)本與配對(duì)TMA標(biāo)本TC SP142判讀

Table 3. Interpretation of SP142 Stain in Tumor Cells in Surgical Specimens and Paired Tissue Microarrays

Surgical sampleChip sample-1+2+3+-1003101+61102+22333+2005

表4 手術(shù)標(biāo)本與配對(duì)TMA標(biāo)本IC SP142判讀

Table 4. Interpretation of SP142 Stain in Immune Cells in Surgical Specimens and Paired Tissue Microarrays

Surgical sampleChip sample-1+2+3+-1003101+61102+22333+0125

圖1 手術(shù)標(biāo)本強(qiáng)陽(yáng)性，配對(duì)TMA標(biāo)本強(qiáng)陽(yáng)性(TC)

Figure1.StronglyPositiveExpressioninBothSurgicalSpecimensandPairedTissueMicroarrays(TumorCells)

Panel A and B show hematoxylin and eosin stain and immunohistochemical staining of PD-L1 (SP142) in surgical specimens and paired tissue microarrays. The red circle indicates the area of tissue microarrays in corresponding resected specimens. PD-L1 expression is highly concordant between surgical specimens and paired TMA.

圖2 手術(shù)標(biāo)本強(qiáng)陽(yáng)性，配對(duì)TMA陰性 (IC)

Figure2.StronglyPositiveExpressioninSurgicalSpecimensandNegativeExpressioninPairedTissueMicroarrays(ImmuneCell)

Panel A and B show hematoxylin and eosin stain and immunohistochemical staining of PD-L1 (SP142) in surgical specimens and paired tissue microarrays. The red circle indicates the area of tissue microarrays in corresponding resected specimens. PD-L1 (SP142) expression in TMA specimens underestimate that in matched resected surgical specimens.

圖3 手術(shù)標(biāo)本弱陽(yáng)性，配對(duì)TMA強(qiáng)陽(yáng)性(TC)

Figure3.WeaklyPositiveExpressioninSurgicalSpecimensandStronglyPositiveExpressioninPairedTissueMicroarrays(TumorCells)

Panel A and B show hematoxylin and eosin stain and immunohistochemical staining of PD-L1 (SP142) in surgical specimens and paired tissue microarrays. The red circle indicates the area of tissue microarrays in corresponding resected specimens. PD-L1 (SP142) expression in TMA specimens underestimate that in matched resected surgical specimens.

圖4 總生存期與手術(shù)標(biāo)本中PD-L1表達(dá)情況的相關(guān)性

Figure4.CorrelationbetweenOverallSurvivalandPD-L1ExpressionofSurgicalSpecimen

圖5 總生存與TMA標(biāo)本中PD-L1染色情況的相關(guān)性

Figure5.CorrelationbetweenOverallSurvivalandPD-L1ExpressionofTMASpecimen

3 討 論

在免疫治療的運(yùn)用中，有效的療效預(yù)測(cè)因子有助于篩選能夠獲得最佳療效受益人群，也是廣受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。PD-L1是目前研究和臨床中應(yīng)用最多的生物標(biāo)志物[4-5]，但是，由于PD-L1本身檢測(cè)試劑克隆號(hào)較多，不同檢測(cè)平臺(tái)以及不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題導(dǎo)致其“預(yù)測(cè)角色”需要謹(jǐn)慎而辯證地對(duì)待[6]。PD-L1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面或腫瘤浸潤(rùn)的微環(huán)境中，但不是所有腫瘤細(xì)胞都有表達(dá)PD-L1[3]，并且PD-L1的表達(dá)本身存在時(shí)間與空間的異質(zhì)性，即同一個(gè)患者不同時(shí)期的PD-L1的表達(dá)可能是不一致的，不同病灶之間甚至同一病灶之間都存在這種表達(dá)不一致的異質(zhì)性。因此，以檢測(cè)PD-L1表達(dá)情況作為預(yù)測(cè)免疫治療療效的指標(biāo)時(shí)存在一定局限性，尤其目前臨床上對(duì)晚期肺癌患者往往使用穿刺小標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，這會(huì)導(dǎo)致更加明顯的不穩(wěn)定性[7-8]。

目前臨床在進(jìn)行PD-L1檢測(cè)時(shí)送檢的病理標(biāo)本往往為氣管鏡或肺穿刺及淋巴結(jié)穿刺的小標(biāo)本，小標(biāo)本是否能夠完全代表整個(gè)腫瘤的PD-L1表達(dá)情況呢？本研究基于這個(gè)想法進(jìn)行了初步探索。我們收集了129例手術(shù)標(biāo)本，以手術(shù)標(biāo)本來(lái)模擬整個(gè)腫瘤，配對(duì)TMA來(lái)模擬臨床送檢的小標(biāo)本，通過(guò)檢測(cè)PD-L1表達(dá)的情況，探討兩者間一致性問(wèn)題。TMA技術(shù)是將若干石蠟包埋塊上的各種組織轉(zhuǎn)移到一個(gè)新石蠟塊上重新構(gòu)建微型化高通量組織陣列的方法，可以有效地進(jìn)行各類臨床病理組織的觀察和研究。TMA技術(shù)可以在一塊切片上同時(shí)放置幾十到一百個(gè)樣品，進(jìn)行高通量的基因和蛋白質(zhì)分析，且能夠充分利用組織資源，將多個(gè)樣品的平行實(shí)驗(yàn)一次性完成。這項(xiàng)技術(shù)近些年主要用于鑒定腫瘤特征的生物標(biāo)志物，并可用于進(jìn)行預(yù)測(cè)標(biāo)志物篩選或通過(guò)回顧性研究尋找生物療法的潛在靶點(diǎn)[9-11]。

有幾項(xiàng)研究對(duì)NSCLC的手術(shù)標(biāo)本及相應(yīng)穿刺小標(biāo)本進(jìn)行了PD-L1表達(dá)的一致性探索，但大多數(shù)研究的結(jié)果都表現(xiàn)出不一致性。其中，僅有Kitazono等[12]的研究顯示了良好的一致性，該研究納入了79例患者，其手術(shù)標(biāo)本與活檢小標(biāo)本的一致性高達(dá)92%。但llie等[9]開(kāi)展的另外一項(xiàng)研究納入了160例NSCLC患者，分析了手術(shù)前診斷小標(biāo)本與術(shù)后標(biāo)本的PD-L1表達(dá)情況，無(wú)論在TC還是IC的判讀上都有較差的一致性，在判讀陰性的小標(biāo)本中與術(shù)后標(biāo)本判讀的不一致性(57/128，46%)。Kitazono的研究使用的PD-L1檢測(cè)試劑與llie使用的檢測(cè)試劑克隆號(hào)不一致可能是導(dǎo)致結(jié)論差異較大的原因，Kitazono的研究使用的PD-L1檢測(cè)抗體為catalog no.4059，llie使用的PD-L1檢測(cè)抗體為SP142。本研究結(jié)果與llie研究相似(總體不一致率為41.9%)。在所有標(biāo)本中，小標(biāo)本均較手術(shù)標(biāo)本低判了PD-L1的表達(dá)，這一點(diǎn)與絕大多數(shù)研究相似。本研究除了發(fā)現(xiàn)配對(duì)TMA低判PD-L1的表達(dá)的情況外，還發(fā)現(xiàn)了配對(duì)TMA標(biāo)本高判的情況，這主要與腫瘤的異質(zhì)性特別是空間異質(zhì)性有關(guān)。本研究與llie均使用SP142進(jìn)行PD-L1檢測(cè)，不同之處則在于本研究使用手術(shù)標(biāo)本與其配對(duì)TMA進(jìn)行比較，而非術(shù)前穿刺小標(biāo)本，這在最大限度上減少了腫瘤的空間異質(zhì)性與時(shí)間異質(zhì)性。

另外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)IC的不一致率遠(yuǎn)高于TC(39.5%vs15.5%)，k值為0.113vs0.489(一致性差與中等一致性)。這種差異主要是病理學(xué)家對(duì)于IC的判讀困難造成的，TC通常顯示為膜染色，IC顯示為細(xì)胞質(zhì)染色，與小淋巴細(xì)胞形態(tài)難以鑒別，均表現(xiàn)為點(diǎn)狀信號(hào)，因此病理學(xué)家對(duì)于IC的判斷似乎更加困惑，這一點(diǎn)在既往研究及我們的研究中都可以看到[3]。

另外TC是陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比值，IC的判讀是對(duì)于陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤區(qū)域的比值，區(qū)域主觀性更強(qiáng)更模糊，除此之外，病理醫(yī)師對(duì)免疫細(xì)胞的觀察能力的不同，這些都導(dǎo)致不同病理科醫(yī)生的判讀結(jié)果一致性差。這一點(diǎn)在藍(lán)印計(jì)劃中同樣得到證實(shí)，病理學(xué)家在對(duì)任何抗體染色的TC進(jìn)行評(píng)分時(shí)顯示出極好的一致性，但對(duì)用任何抗體染色的IC評(píng)分差異較大[7]。

在石蠟包埋組織的IHC研究中，在使用5%的細(xì)胞染色閾值判讀陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，不同文獻(xiàn)報(bào)道的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)范圍從19.6%到57.5%[12-14]。在我們的研究中，以同樣5%的細(xì)胞染色作為閾值判讀的陽(yáng)性率僅為24例(18.7%)(TC3/2和/或IC3/2)，遠(yuǎn)低于其他研究數(shù)據(jù)，這可能與本研究使用SP142抗體有關(guān)。Rimm等[13]的研究在2個(gè)獨(dú)立的染色平臺(tái)上評(píng)估了4種不同的PD-L1抗體，由多名病理科醫(yī)生盲態(tài)下對(duì)4種不同克隆號(hào)的PD-L1檢測(cè)判讀的一致性進(jìn)行了比較，研究中比較了DakoLink 48平臺(tái)上的28-8抗體，Dako Link 48平臺(tái)上的22c3抗體，Ventana Benchmark平臺(tái)上的SP142抗體和Leica Bond平臺(tái)上的E1L3N抗體。在90個(gè)樣本中，SP142抗體的判讀與其余三個(gè)克隆號(hào)的判讀結(jié)果顯示了統(tǒng)計(jì)學(xué)上低判差異，而另外3個(gè)克隆號(hào)的判讀結(jié)果顯示了較好的一致性。一些研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)率可能與腫瘤分期、預(yù)后有關(guān)[14-17]，但2019年發(fā)布的EXPRESS研究結(jié)果則顯示PD-L1的表達(dá)與人種、年齡、性別、病理類型、吸煙史、原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶都沒(méi)有相關(guān)性，而是主要跟EGFR及ALK是否突變狀態(tài)有關(guān)，這是目前真實(shí)世界研究中關(guān)于PD-L1(22C3抗體)最大樣本量的數(shù)據(jù)。本研究為中國(guó)較大樣本量的真實(shí)數(shù)據(jù)研究，結(jié)果顯示，PD-L1的表達(dá)情況與患者的總生存情況也無(wú)相關(guān)性，與EXPRESS研究類似[18]。由于本研究樣本量較小，該結(jié)果尚需在規(guī)模更大的患者組中驗(yàn)證。

PD-L1在TMA樣本中往往出現(xiàn)低判，這部分解釋了臨床治療時(shí)部分PD-L1陰性的患者接受免疫治療仍可能有效，因此在臨床活檢標(biāo)本出現(xiàn)陰性的情況下，我們需慎重對(duì)待，盡可能多結(jié)合其他免疫預(yù)測(cè)指標(biāo)綜合考慮，比如需要結(jié)合TMB等其他標(biāo)志物避免遺漏獲益患者。本研究在避免了時(shí)間異質(zhì)性的基礎(chǔ)上手術(shù)標(biāo)本與配對(duì)TMA仍表現(xiàn)出不一致性，這可能與空間異質(zhì)性有關(guān)，因此如果臨床操作可行的話，進(jìn)行多點(diǎn)穿刺送檢標(biāo)本的PD-L1表達(dá)可能更有指導(dǎo)意義。

我們的研究未對(duì)標(biāo)本的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)及鼠類肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)情況進(jìn)行評(píng)估，因此并未進(jìn)一步分析PD-L1表達(dá)與EGFR、ALK及KRAS之間的關(guān)聯(lián)。有證據(jù)表明，驅(qū)動(dòng)基因EGFR的突變激活免疫逃避，此外，EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療可下調(diào)PD-L1在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)。這與目前研究中EGFR突變的患者PD1/PD-L1單抗治療效果欠佳有一定相符性[18]，EXPRESS中也提到EGFR突變患者免疫治療效果不好，各大指南中目前也是排除EGFR、ALK突變患者在一線使用免疫治療。另外，本研究為術(shù)后標(biāo)本，生存預(yù)后主要與分期有關(guān)，因此在統(tǒng)計(jì)權(quán)重上占過(guò)多比例可能導(dǎo)致其他因素與預(yù)后的相關(guān)性不強(qiáng)。最后，本研究最大的局限性在于回顧性研究，且沒(méi)有PD-1/PD-L1單抗后續(xù)治療的進(jìn)一步研究。

總體而言，在不盡如人意的臨床數(shù)據(jù)中大家認(rèn)識(shí)到，盡管PD-L1不是一個(gè)最佳的生物標(biāo)志物，但是在目前有限的預(yù)測(cè)指標(biāo)中仍是可用的生物標(biāo)志物。在強(qiáng)陽(yáng)性的判讀中仍然有較好的指導(dǎo)意義，但是在中等陽(yáng)性及陰性的判讀中，小標(biāo)本是否能夠代表全身PD-L1表達(dá)狀態(tài)的意義需要慎重考慮，對(duì)于選擇優(yōu)勢(shì)人群或者剔除非優(yōu)勢(shì)人群仍然存在較大的困擾。多點(diǎn)穿刺標(biāo)本減少空間異質(zhì)性可能值得在臨床進(jìn)行推薦，這需要更多的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

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