紫外分光光度法測定人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)外液中阿司匹林的含量

朱星枚 高晨 王川 王國全 王斌 劉繼平

[摘要] 目的 建立人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液中阿司匹林含量測定的紫外分光光度法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)、外液中阿司匹林含量。 方法 采用紫外分光光度法測定細(xì)胞內(nèi)、外液阿司匹林含量，測定波長為276 nm。結(jié)果 在30～130 μg/mL范圍內(nèi)，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液中阿司匹林濃度與吸光度的線性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y=0.007X-0.021（r = 0.9995，n = 5）;Y=0.006X+0.061（r = 0.9995，n = 5）;平均回收率分別為96.6%（RSD = 1.0%）、98.4%（RSD = 0.8%）;日內(nèi)精密度RSD分別為2.3%和2.4%，日間精密度RSD分別為2.2%和2.3%。細(xì)胞內(nèi)、外液定量限均為20 μg/mL，細(xì)胞內(nèi)液檢測限為10 μg/mL，細(xì)胞外液檢測限為1.25 μg/mL。結(jié)論 該紫外分光光度法可用于測定MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液中阿司匹林的含量，且該法簡便、易行，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。

[關(guān)鍵詞] 阿司匹林;紫外分光光度法;MDA-MB-231細(xì)胞;細(xì)胞內(nèi)液;細(xì)胞外液;含量測定

[中圖分類號] R927.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（a）-0030-04

[Abstract] Objective To establish an ultraviolet spectrophotometric method for the determination of Aspirin in the intracellular and extracellular fluid of human breast cancer cell line MDA-MB-231 and to dynamically monitor the content of Aspirin in the intracellular and extracellular fluid. Methods The contents of Aspirin in intracellular and extracellular fluids were determined by ultraviolet spectrophotometry with a wavelength of 276 nm. Results In the range of 30～130 μg/mL， the linear relationship between Aspirin concentration and absorbance in the intracellular and extracellular fluid of human breast cancer cell line MDA-MB-231 were good. The regression equation were Y=0.007X-0.021 （r = 0.9995， n = 5）; Y=0.006X+0.061 （r = 0.9995， n = 5）; the average recoveries were 96.6% （RSD = 1.0%） and 98.4% （RSD = 0.8%）， respectively; intraday precision RSD were 2.3% and 2.4%， daytime precision RSD were 2.2% and 2.3%， respectively. The limit of quantification of both intracellular and extracellular fluids was 20 μg/mL， the limit of detection of intracellular fluid was 10 μg/mL， and the limit of detection of extracellular fluid was 1.25 μg/mL. Conclusion Ultraviolet spectrophotometry can be used to determine the content of Aspirin in the intracellular and extracellular fluid of human breast cancer cell line MDA-MB-231. The method is simple， easy， accurate and reproducible.

[Key words] Aspirin; Ultraviolet spectrophotometry; MDA-MB-231 cells; Intracellular fluid; Extracellular fluid; Determination

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，每日低劑量服用阿司匹林可預(yù)防乳腺腫瘤發(fā)生，而長期大量服用阿司匹林會(huì)使黏膜受到損傷，引起胃腸道出血[1-7]。因此，探討阿司匹林含量測定方法對促進(jìn)應(yīng)用阿司匹林防治乳腺腫瘤的安全性評價(jià)有著重要意義。

2015年版《中華人民共和國藥典》[8]以下簡稱“《中國藥典》”規(guī)定：阿司匹林含量測定使用酸堿中和滴定法，但實(shí)際操作繁瑣且終點(diǎn)不易辨認(rèn)，誤差較大。紫外分光光度法相對誤差通常在5%左右，是藥學(xué)領(lǐng)域最常用的含量測定方法之一。阿司匹林具有紫外吸收特性，可用紫外分光光度法監(jiān)測其動(dòng)態(tài)濃度[9-13]。本研究建立紫外分光光度法測定人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液阿司匹林濃度，并分析不同濃度阿司匹林處理后人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液中其含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外分光光度儀（UV1102，上海天美科學(xué)儀器有限公司）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（411，賽默飛世爾科技中國有限公司）、離心機(jī)（5804R，Eppendorf），細(xì)胞粉碎機(jī)（60648，Parmer）、分析天平（BT25S，德國賽多利斯公司），六孔板（140675，Thermo）。

1.2 試藥

乙酰水楊酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100113-201706，純度：99.8%）;阿司匹林原料藥（Sigma-Aldrich中國，批號：A6810，純度：99%）;三氯醋酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號：20170925）;氫氧化鈉（天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號：20160608）;濃鹽酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號：201503 11）;生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：171222 2322）;純化水（陜西中醫(yī)藥大學(xué)）;DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，貨號：1342937）;小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：170609）。

1.3 細(xì)胞系

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞（空軍軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室饋贈(zèng)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基在恒溫恒濕培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)。常規(guī)傳代，2～3 d換液1次。

2.2 阿司匹林處理人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞

MDA-MB-231細(xì)胞貼壁80%時(shí)，棄培養(yǎng)液，常規(guī)消化，800 r/min離心5 min，離心半徑9.5 cm。將細(xì)胞重新種到6孔板中，分為空白對照組和加藥實(shí)驗(yàn)組（包括高、中、低3個(gè)亞組），其中，高、中、低組阿司匹林濃度分別為1080、720、486 μg/mL。分別在37℃，5% CO2條件下避光孵育36 h。

2.3 對照品儲(chǔ)備液制備

精密稱取乙酰水楊酸對照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加入一定量的乙醇將其溶解，定容，于-20 ℃保存，備用。

2.4 樣品處理

2.4.1 細(xì)胞內(nèi)液處理

吸取細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，留作細(xì)胞外液測定，備用。貼壁細(xì)胞用胰酶消化，800 r/min離心5 min，離心半徑9.5 cm，再加入0.30 mol/L的鹽酸乙醇溶液10.0 mL，混勻震蕩3 min，于-78℃快速冷凍，再于37℃迅速解凍后超聲5 min（70 W）。重復(fù)進(jìn)行3次凍融超聲，然后5000 r/min離心10 min，取上清液備用。

2.4.2 細(xì)胞外液處理

取“2.4.1”項(xiàng)下的備用上清液10 mL，加入三氯醋酸1.63 g，混勻，沉淀蛋白，再加入2.0 mol/L氫氧化鈉溶液800 μL，5000 r/min離心10 min，取適量上清液備用。

2.5 紫外分光光度法分析

2.5.1 測定波長的選擇

取一定量的阿司匹林對照品儲(chǔ)備液，加入乙醇稀釋，制成含阿司匹林80 μg/mL的溶液，并于240～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，選擇最大吸收波長276 nm作為阿司匹林含量測定的檢測波長。

2.5.2 線性關(guān)系考察

2.5.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制? 取“2.3”項(xiàng)下對照品儲(chǔ)備液，精密吸取對照品儲(chǔ)備液0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.3 mL，置于10 mL量瓶中，分別以乙醇為溶劑稀釋、定容，于276 nm波長處測定其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)（X），以吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.006X+0.005（r = 0.9995，n=5）。

2.5.2.2 細(xì)胞外液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制? 將空白對照組細(xì)胞外液及加藥實(shí)驗(yàn)組的高（1080 μg/mL）、中（720 μg/mL）、低（486 μg/mL）組的細(xì)胞外液分別稀釋5倍，于276 nm波長處測得吸光度在0.2～0.9。分別吸取0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.3 mL的對照品儲(chǔ)備液，置于10 mL容量瓶中，并用稀釋5倍的細(xì)胞外液定容。以稀釋5倍的細(xì)胞外液為空白，于276 nm波長處測定吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)（X），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.006X+0.061（r = 0.9995，n = 5），其在30～130 μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞外液阿司匹林濃度與吸光度線性良好。

2.5.2.3 細(xì)胞內(nèi)液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制? 將空白對照組細(xì)胞內(nèi)液及加藥實(shí)驗(yàn)組的高（1080 μg/mL）、中（720 μg/mL）、低（486 μg/mL）組細(xì)胞內(nèi)液，于276 nm波長處測定吸光度均在0.2～0.9。分別取0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.3 mL的對照品儲(chǔ)備液，置于10 mL容量瓶中，用細(xì)胞內(nèi)液定容。以細(xì)胞內(nèi)液為空白，在276 nm波長處測定吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)（X），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.007X-0.021（r = 0.9995，n = 5），其在30～130 μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞內(nèi)液阿司匹林濃度與吸光度線性良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn)

制備高（120 μg/mL）、中（80 μg/mL）、低（40 μg/mL）3種濃度的細(xì)胞內(nèi)、外液樣品，按“2.5.2.2”“2.5.2.3”項(xiàng)下的方法分別處理，采用1 d內(nèi)測定5次，每2 h測定1次的方法考察乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液樣品日內(nèi)精密度。采用連續(xù)測定5 d，每天測定1次的方法得到人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液日間精密度。細(xì)胞內(nèi)、外液日內(nèi)和日間精密度結(jié)果見表1。

2.5.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取含阿司匹林的細(xì)胞內(nèi)、外液，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液6份，按“2.5.2.2”“2.5.2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線分別進(jìn)行測定，每份供試品測定3次，取均值，測得細(xì)胞內(nèi)、外液RSD分別為1.72%、2.38%。表明該法重現(xiàn)性較好。

2.5.5 回收率試驗(yàn)

制備高（120 μg/mL）、中（80 μg/mL）、低（40 μg/mL）3種濃度的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液樣品，按照“2.5.2.2”“2.5.2.3”項(xiàng)下的方法分析，計(jì)算回收率，得出人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液的平均回收率。表2。

2.5.6 定量限和檢測限

按照“2.5.2.2”“2.5.2.3”項(xiàng)下方法制備不同濃度的細(xì)胞內(nèi)、外液樣品，按定量限和檢測限的要求分別進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：細(xì)胞內(nèi)、外液阿司匹林的定量限均為20 μg/mL，細(xì)胞內(nèi)、外液檢測限分別為10、1.25 μg/mL。

2.5.7 含量測定

將人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞分別種于培養(yǎng)皿中（5×105/皿），分為空白對照組和加藥實(shí)驗(yàn)組（包括高、中、低3個(gè)亞組），其中，高、中、低組阿司匹林濃度分別為1080、720、486 μg/mL。培養(yǎng)36 h后，分別測定各組細(xì)胞內(nèi)、外液中阿司匹林含量。測得人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞外液中樣品濃度分別為562、350、148 μg/mL;人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)液中樣品濃度分別為425、354、304 μg/mL。

3 討論

阿司匹林預(yù)防乳腺癌的途徑可能涉及血小板、炎癥、環(huán)氧合酶2（COX2）、激素或磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）[14-19]，且其作用機(jī)制、副作用均與阿司匹林的用量有一定關(guān)系。因此，有必要探索簡便、可行的測定阿司匹林動(dòng)態(tài)藥物濃度的方法，為安全有效使用阿司匹林提供依據(jù)。

本研究建立的紫外分光光度法考察了不同藥物濃度作用相同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)、外的阿司匹林含量變化。結(jié)果顯示，阿司匹林能夠進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)液，隨著阿司匹林處理濃度的增加，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液中阿司匹林的含量均呈現(xiàn)增高的趨勢，但是低劑量時(shí)細(xì)胞內(nèi)、外液中阿司匹林的含量比最高。

2015版《中國藥典》規(guī)定：阿司匹林含量測定使用酸堿中和滴定法，但其實(shí)際操作繁瑣，需要分次研磨阿司匹林，終點(diǎn)不易辨認(rèn)，誤差較大。本法的測定對象涉及細(xì)胞內(nèi)、外液，檢測靈敏度要求更高。為提高細(xì)胞內(nèi)液藥物檢測靈敏度，本研究采用反復(fù)凍融破碎細(xì)胞膜，加入三氯醋酸沉淀蛋白，不僅提高細(xì)胞外液藥物檢測靈敏度，而且縮短樣品處理時(shí)間[20]。該法測定阿司匹林細(xì)胞內(nèi)、外液含量簡便、準(zhǔn)確，可用于快速分析人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)、外液的藥物濃度。

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（收稿日期：2018-11-30? 本文編輯：王? ?蕾）