I型膠原與異丙腎上腺素調(diào)控三維培養(yǎng)膠上大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的分枝結(jié)構(gòu)形成*

錢(qián)智莉，鄧林紅，歐陽(yáng)明星

(常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州 213164 )

1 引 言

細(xì)胞群體形態(tài)學(xué)是個(gè)體發(fā)育和組織生物工程領(lǐng)域的重要研究方向。近些年的研究顯示，I型膠原(Type I Collagen)在形態(tài)發(fā)生學(xué)上具有獨(dú)特的功能，例如介導(dǎo)細(xì)胞間的長(zhǎng)距離相互作用，通過(guò)生成的膠原纖維帶誘導(dǎo)上皮管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生[1-2]，或?yàn)槟[瘤細(xì)胞的定向遷移提供通路[3]。

氣道平滑肌為呼吸系統(tǒng)的氣道提供了結(jié)構(gòu)支撐和收縮功能[4-5]，而平滑肌層的增厚和力學(xué)性能改變也成為慢性哮喘的病理機(jī)理研究中，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性現(xiàn)象(airway hyper-responsiveness, AHR)的關(guān)鍵方向[6-7]。臨床上，異丙腎上腺素(ISO)作為一種哮喘氣道高反應(yīng)性的舒張藥物，作用于支氣管平滑肌β2受體，產(chǎn)生較強(qiáng)的舒張作用，解除支氣管痙攣[8]。考慮平滑肌細(xì)胞的力學(xué)性能在實(shí)現(xiàn)呼吸功能和在哮喘氣道高反應(yīng)性中的重要性，以及聯(lián)系我們此前的研究發(fā)現(xiàn)，即I型膠原介導(dǎo)細(xì)胞長(zhǎng)程力作用誘導(dǎo)上皮管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生[1]，本研究初步探索了在含有I型膠原的三維matrigel上，大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生。

在體內(nèi)，I型膠原常以長(zhǎng)纖維束的形態(tài)廣泛存在于多種組織中[9]；體外分離的I型膠原也能重新形成水凝膠狀，或組裝成纖維絲[10]?；|(zhì)膜(basement membrane, BM)是常見(jiàn)于上皮層、內(nèi)皮層、間皮層等組織中一種層狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)，其主要結(jié)構(gòu)成分包含IV型膠原(Collagen IV)、層粘連蛋白、巢蛋白、基底膜蛋白多糖等[11]。從富含胞外基質(zhì)蛋白的小鼠腫瘤中分離出的Matrigel，成分和基質(zhì)膜相似，常用作基質(zhì)膜的代替產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)操作中，Matrigel在4℃下是溶液狀態(tài)，轉(zhuǎn)移到37℃后變成凝膠態(tài)，這個(gè)過(guò)程也是可逆的，因此常用于三維水凝膠的制作[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)在含I型膠原的三維matrigel上，12～16 h內(nèi)自動(dòng)生成多個(gè)的分枝形態(tài)結(jié)構(gòu)，而在不含I型膠原的三維matrigel上，或包被有I型膠原的玻璃皿上，細(xì)胞都不會(huì)出現(xiàn)分枝形態(tài)結(jié)構(gòu)，顯示I型膠原和該三維水凝膠環(huán)境都是必要因素。用氣道平滑肌舒張劑異丙腎上腺素處理后，分枝形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)生也極大地被抑制，提示依賴于I型膠原的該分枝形態(tài)發(fā)生需要生物力學(xué)因素的參與。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性Sprague Dawley大鼠(簡(jiǎn)稱SD大鼠)，常州卡文斯動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司；培養(yǎng)瓶、共聚焦皿，美國(guó)corning公司(Corning,NY)。

2.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司；生物安全柜(BSC-1300ⅡA2)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；超級(jí)純水儀(Milli Q Plus,Integral 10)，美國(guó)Millipore公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Coulter Allegra X-30R)，美國(guó)Beckman公司；倒置顯微鏡(Primo Vert)、倒置熒光顯微鏡(cell observer)、激光共聚焦顯微鏡(LSM710)，德國(guó)Zeiss公司；酶聯(lián)免疫分析儀(Infinite F50)，瑞士TECAN公司；體視顯微鏡(S8APO)，德國(guó)Leica公司。

2.3 試劑

鹽酸異丙腎上腺素，上海源葉生物科技有限公司；鼠尾I型膠原，R&D System；Matrigel，美國(guó)BD Bioscience公司；杜氏改良培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司; 噻唑藍(lán)(methylthiazolydiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)，美國(guó)Sigma公司;戊巴比妥鈉，德國(guó)Merck公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

2.4 大鼠ASM細(xì)胞原代培養(yǎng)

本研究采用參考文獻(xiàn)[13]的原代平滑肌細(xì)胞提取方法對(duì)SD大鼠ASM細(xì)胞進(jìn)行體外分離和原代培養(yǎng)。首先注射戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)于SD大鼠腹腔進(jìn)行麻醉，在潔凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)胸腔取出氣道，遂立即放入盛有適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)(pH7.4)的培養(yǎng)皿中。然后在體視顯微鏡下用鑷子輕輕剝離氣道黏膜層，將氣道組織在PBS溶液中剪成約1 mm ×1 mm×1 mm的碎塊，用PBS離心棄上清又重懸3次后，加入胰蛋白酶(0.1%)至沒(méi)過(guò)組織塊，將其置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化15 min，隨后添加含20% FBS的培養(yǎng)基終止消化。預(yù)冷離心機(jī)至4℃，將組織塊重懸后1 600 r/min離心4 min,棄去上清，加入含80% DMEM、20% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基，重懸組織塊并將組織塊均勻分布于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。最后，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)后加入1mL完全培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)約2～3 d后有細(xì)胞爬出。大約10 d后，細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)“峰-谷”狀。采用免疫熒光染色技術(shù)標(biāo)記α-SMA，鑒定差時(shí)貼壁法純化后的細(xì)胞為大鼠ASM細(xì)胞，取4～10代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 三維基底膠的制作

本次對(duì)細(xì)胞行為的研究均在三維基底膠上實(shí)現(xiàn)。具體操作方法為：先將PDMS與交聯(lián)劑以10：1比例混合，充分?jǐn)嚢柚粮黜?xiàng)均勻后，加入皿里自然鋪開(kāi)，制成一張厚度約為600 μm的PDMS膜，然后用模具壓出內(nèi)徑為1 cm的正方形或0.6 cm的圓環(huán)，滅菌后，利用PDMS表面的疏水性緊密貼合于共聚焦皿底部的玻璃表面，使共聚焦皿底部出現(xiàn)一個(gè)PDMS圓環(huán)。將裝有PDMS圓環(huán)的共聚焦皿置于冰上預(yù)冷，在冰上將預(yù)冷的CollagenI(COL I)加入Matrigel中配置成含有0.5 mg/mL COL I的Matrigel溶液，加入30 μL溶液使其填平PDMS圓環(huán)的內(nèi)部，放入37℃培養(yǎng)箱30 min成膠后即可在上面接種細(xì)胞。

2.6 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

取2.4節(jié)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠ASM細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h 后換成無(wú)血清培養(yǎng)基 (DMEM中加人5 mg/L胰島素、5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、100 U/mL青霉素和 100 pg/mL 鏈霉素 ) ， 12 h 后培養(yǎng)皿分別加入終濃度為 0、10、20、40、80、160、320、640 μm/L鹽酸異丙腎上腺素,每個(gè)組10個(gè)復(fù)孔。將加藥后的96孔板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,每孔加入MTT(5 mg/mL)各20 μL，孵育 4 h 后，輕輕吸去液體，每孔加入200 μL的DMSO,將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置于搖床上振蕩10 min后，用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定波長(zhǎng)為495nm下的光密度值,進(jìn)而篩選ISO作用的安全濃度,以排除ISO的可能細(xì)胞毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

3 結(jié)果

3.1 三維培養(yǎng)膠上大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的分枝結(jié)構(gòu)發(fā)生

根據(jù)我們以前的研究累積[1]，以及考慮氣道平滑肌細(xì)胞力學(xué)性能的生理重要性，本研究在含有0.5 mg/mL I型膠原的三維matrigel膠上先初步研究大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的群體行為。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室加工了內(nèi)徑為1 cm ×1 cm，高度約0.6 mm，底部為共聚焦皿玻璃底的方形槽，然后在槽中把膠做好，把細(xì)胞(2.0×104個(gè)細(xì)胞/m2)培養(yǎng)在膠上。12～16 h后，細(xì)胞已快速形成了許多分枝的形態(tài)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1(a)。相對(duì)照，把細(xì)胞培養(yǎng)在包被有I型膠原，matrigel或matrigel+I型膠原混合溶液的共聚焦皿平面上，雖然生長(zhǎng)良好，但不會(huì)形成分枝結(jié)構(gòu)，而是以獨(dú)立的單個(gè)細(xì)胞形態(tài)存在，見(jiàn)圖1(b)。這揭示在細(xì)胞群體水平上，分枝結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生依賴底部的三維膠環(huán)境。

圖1三維培養(yǎng)膠上大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的分枝結(jié)構(gòu)發(fā)生(a).約2.0×104個(gè)ASM細(xì)胞種植在1cm×1cm的方形三維matrigel上(含有0.5mg/mL COL I)，培養(yǎng)16h后細(xì)胞分枝形態(tài)的形成；(b).ASM細(xì)胞種植在表面包被有COL I，matrigel，或matrigel+COL I的共聚焦玻璃皿上，培養(yǎng)約16h后的形態(tài)

Fig.1The branching morphogenesis of ASM cells cultured on3D matrigel with COL I(a).The branching morphology of2.0×104ASM cells after cultured for16h on1cm×1cm square size of3D matrigel with0.5mg/ml COL I；(b).The morphology of ASM cells after16h culture on glass-bottom dishes coated with matrigel, COL I, or mixture of both

3.2 I型膠原調(diào)控三維膠上細(xì)胞分枝結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生

我們檢測(cè)了I型膠原在細(xì)胞分枝形態(tài)發(fā)生中的必要性。在不含I型膠原的三維matrigel上，培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞僅形成一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞團(tuán)形態(tài)；相比較，當(dāng)存在I型膠原時(shí)，三維膠上的細(xì)胞分散相連形成分枝形態(tài)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2(a)，因此，I型膠原成分和三維膠都是必要的。

為了初步分析這種分枝形態(tài)發(fā)生是否與平滑肌細(xì)胞本身的特性有相關(guān)性，我們也觀察了來(lái)自人源的氣道上皮細(xì)胞(HBEC)在相似培養(yǎng)條件下的形態(tài)發(fā)生。在體內(nèi)，氣道上皮和氣道平滑肌之間有間質(zhì)細(xì)胞和胞外基質(zhì)，在慢性哮喘中，上皮層表面變得粗糙，平滑肌層增厚，兩層之間的間隔縮小[14]。實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)HBEC培養(yǎng)在不含I型膠原的三維matrigel膠上，也形成類似平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)；當(dāng)膠中存在I型膠原時(shí)，HBEC細(xì)胞之間明顯存在類似纖維帶的連接，顯示I型膠原在促進(jìn)分枝形態(tài)發(fā)生中的一個(gè)普遍性作用，見(jiàn)圖2(b)。同時(shí)，這兩種細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的差異性，也提示了平滑肌細(xì)胞的特性包括力學(xué)性能促進(jìn)了其特色分枝形態(tài)的發(fā)生。

圖2I型膠原調(diào)控三維膠上細(xì)胞分枝結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生(a).ASM細(xì)胞種植在純matrigel或matrigel+COL I(0.5mg/mL)形成的三維膠上，培養(yǎng)約16h后的形態(tài)發(fā)生；(b).人源的HBEC細(xì)胞種植在純matrigel或matrigel+COL I(0.5mg/mL)形成的三維膠上，培養(yǎng)約16h后的形態(tài)發(fā)生

Fig.2COL I mediates the branching morphogenesis of ASM cells(a).The morphology of ASM cells after cultured for16h on3D matrigel only or containing COL I (0.5mg/mL)；(b).The morphology of homo HBEC cells after cultured for16h on3D matrigel only or containing COL I (0.5mg/mL)

3.3 舒張劑異丙腎上腺素抑制平滑肌細(xì)胞分枝形態(tài)的發(fā)生

臨床的哮喘治療中，異丙腎上腺素(ISO)和氣道平滑肌細(xì)胞的β-激動(dòng)劑受體結(jié)合，對(duì)氣道有快速舒張作用。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中檢測(cè)了異丙腎上腺素對(duì)平滑肌細(xì)胞群體分枝形態(tài)發(fā)生的影響。見(jiàn)圖3，培養(yǎng)體系中存在100 μM ISO時(shí)，分枝形態(tài)很大程度上被抑制，150 μM ISO則起到了基本完全的抑制作用。這結(jié)果初步提示了I型膠原誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞分枝結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生需要生物力學(xué)因素的參與。同時(shí)，該分枝形態(tài)模型也可能成為臨床哮喘藥物開(kāi)發(fā)中，初步檢測(cè)氣道平滑肌舒張藥物作用效果的一個(gè)快捷的潛在模型。

4 討論

細(xì)胞群體形態(tài)學(xué)是個(gè)體發(fā)育和組織生物工程領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。本研究初步探索了氣道平滑肌細(xì)胞在三維matrigel膠上的形態(tài)發(fā)生，證實(shí)三維膠培養(yǎng)和I型膠原是細(xì)胞自發(fā)生成分枝形態(tài)結(jié)構(gòu)的必要微環(huán)境，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也初步提示該形態(tài)發(fā)生需要生物力學(xué)因素的參與。這些觀察為理解多細(xì)胞形態(tài)發(fā)生學(xué)提供了一定的素材。

臨床緩解哮喘癥狀的氣道舒張藥物異丙腎上腺素有效抑制了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭写笫髿獾榔交〖?xì)胞的分枝結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生。這從側(cè)面提示，作為一個(gè)簡(jiǎn)捷初步的測(cè)試模型，分枝結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生可能具有臨床氣道舒張藥物效果的檢測(cè)功能。作為一個(gè)輔助方法，該檢測(cè)模型將比常用的小鼠哮喘模型具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)勢(shì)。

圖3舒張劑異丙腎上腺素(ISO)抑制平滑肌細(xì)胞分枝形態(tài)的發(fā)生(a).ASM細(xì)胞種植在三維matrigel+COL I膠上，培養(yǎng)基中存在對(duì)照DMSO，100μM或150μM ISO的條件下，培養(yǎng)約16h后細(xì)胞群體形態(tài)的發(fā)生情況；(b).在存在不同濃度ISO的培養(yǎng)條件下，用MTT分析法檢測(cè)24h后ASM細(xì)胞的存活率(mean+S.D.)，高吸光值(OD495nm)代表高存活率

Fig.3The airway relaxation reagent ISO inhibits the branching morphogenesis(a).The morphology of ASM cells after16h culture on3D matrigel with COL I in culture medium containing100μM or150μM ISO, or DMSO as control；(b).Detection of alive ASM cells by MTT assay (mean+S.D.) after24h culture in medium containing different concentrations of ISO.Higher absorptions at495nm represents higher alive rate

作為一種呼吸系統(tǒng)慢性疾病，全球約有3億哮喘患者，影響到人們正常的生活工作，而且哮喘發(fā)生率不因地區(qū)經(jīng)濟(jì)水平的提升而下降[15]。研究和治療方面的進(jìn)展主要體現(xiàn)在抑制氣道炎癥反應(yīng)和減輕因氣道平滑肌層增厚而引起的氣道高反應(yīng)性[16]。正常情況下，氣道平滑肌層具有收縮和舒張的生理功能，而在哮喘氣道高反應(yīng)現(xiàn)象中，平滑肌層保持收縮狀態(tài)，導(dǎo)致支氣管通氣受阻，因此嚴(yán)重影響到患者的生活健康，甚至危及生命[17]。了解平滑肌層細(xì)胞的力學(xué)性能及其變化有助于理解氣道高反應(yīng)現(xiàn)象的病理基礎(chǔ)，或許能為臨床治療甚至逆轉(zhuǎn)哮喘發(fā)病條件提供理論研究上的線索。我們的工作為研究氣道平滑肌的力學(xué)性能提供了一個(gè)簡(jiǎn)便的模型。