基于層層自組裝技術與季銨鹽類抗菌劑接枝制備表面抗菌涂層的研究*

周俊濤，潘艷，周超，鄧林紅△

(1. 常州大學材料科學與工程學院，江蘇常州 213164；2. 常州大學生物醫(yī)學工程與健康科學研究院，江蘇常州 213164)

1 引 言

生物醫(yī)用材料在臨床應用中，由于細菌的粘附與增殖，會在患者體內引起嚴重的細菌感染，甚至威脅到患者的生命安全[1-3]。因此，一般需要對生物醫(yī)用材料表面進行修飾，使其具有抗菌功能。近幾年，層層自組裝技術由于工藝簡單，厚度可控，適用于結構復雜的表面等優(yōu)點而廣泛應用于生物醫(yī)用材料的表面修飾[4]。該技術通過靜電力的作用將帶有異種電荷的聚電解質鏈交替沉積在基底材料表面來制備多功能涂層，如，Li等[5]通過層層自組裝技術將聚(2-乙基-2-惡唑啉)和聚丙烯酸交替沉積，制備出一種結構穩(wěn)定的自組裝涂層。該涂層具有超親水表面，通過空間排斥來阻斷細菌的初始粘附，但因不具備直接殺滅細菌的功能，故抗菌性能一般。

為提高抗菌性能，使涂層表面具有殺菌功能很有必要。目前，實現(xiàn)表面殺菌的方法可以分為兩類。釋放殺菌：表面包裹抗菌劑，在外界刺激作用下，釋放抗菌劑，殺死材料表面及附近細菌[6-7]。但是，抗菌聚合物釋放完后就失去了表面抗菌的作用。接觸殺菌：表面接枝帶有正電荷的物質，如Ag+，Mg2+等重金屬離子，通過表面電荷作用殺滅材料表面粘附的細菌[1, 8-9]。雖然重金屬離子可以殺菌，但會對人體的正常生理組織造成傷害。因此，在自組裝涂層表面接枝生物相容性較好的抗菌聚合物成為人們研究的熱點。在前期工作中，采用輔助活化還原原子轉移自由基聚合(SARA ATRP)的方法獲得了一種生物相容性好且殺菌效率高的季銨鹽類抗菌聚合物，其合成路線簡單，催化劑用量少，反應條件溫和[10]，但尚未有研究將該抗菌聚合物接枝到自組裝抗菌涂層中并考察其表面的抗菌性能。

因此，本研究首先通過層層自組裝技術制備表面抗細菌粘附的涂層，再通過“巰基-烯”點擊反應(Thiol-ene Click Reaction)，將末端為巰基修飾而且有殺菌性能的季銨鹽類抗菌聚合物接枝到含氧降冰片烯結構的涂層中，使涂層表面具有抗細菌粘附以及長效殺菌的功能。實驗表明，該表面抗菌涂層不僅擁有較好的生物相容性，而且大幅度提高其表面的抗菌性能。

2 實驗部分

2.1 材料與儀器

聚乙烯亞胺(PEI, Mw 10 000), 聚丙烯酸(PAA,Mw 100 000), 多巴胺鹽酸鹽(Dopamine Hydrochloride,98%), 3-馬來酰亞胺基丙酸(3-Maleimidopropionic Acid, 97%), 糠胺(2-Furfurylamine,99%), 三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris·HCl,99%), 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,99%), N-羥基琥珀酰亞胺(NHS, 99%), 2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(IRGACURE 2959, 98%), DL-二硫蘇糖醇(DTT,99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MH培養(yǎng)基，美國索萊寶公司；胰蛋白胨，賽默飛世爾科技；酵母粉，OXOID；瓊脂粉，上海潤捷化學試劑有限公司；DEME高糖和胰蛋白酶，賽默飛世爾科技；鹽酸(HCl,37%), 濃硫酸(H2SO4,98%), 雙氧水(H2O2,30%), 無水乙醇(C2H5OH)，氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)，氫氧化鈉(NaOH)，碳酸氫鈉(NaHCO3), 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)， 磷酸二氫鉀(KH2PO4)， 二氯甲烷(CH2Cl2)， 四氫呋喃(THF)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，無水甲醇(CH3OH，分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

冷凍干燥機，2.5 L， Freezone公司；pH計，PB-10，Sartorius公司；倒置式顯微鏡，Primo Vert，德國-卡爾蔡司；超凈工作臺，VS-1300L-U，AIRTECH公司；核磁共振波普儀，AVANCEⅡ 500 M，德國布魯克；傅里葉紅外光譜儀，Nicolet A vatar 370,Thermo Fisher；水接觸角測試儀。

2.2 聚陽離子電解質的合成

在圓底燒瓶中加入PEI (1 g,0.0233 mol)，用50 mL 1X PBS溶液將其溶解，再加入NHS (2.68 g,0.0233 mol)、EDC (4.46 g,0.0233 mol)，在37 ℃水浴下攪拌活化6 h，轉速為360 rpm，接著加入3-Maleimidopropionic Acid (3.93 g，0.0233 mol)，繼續(xù)攪拌48 h。待反應結束后，透析24 h，以除去未反應的小分子物質。通過冷凍干燥得到絮狀物PEI-M。反應方程式見圖1(a)。

2.3 聚陰離子電解質的合成

在圓底燒瓶中加入PAA (1 g，0.0139 mol)，用50 mL 1X PBS溶液將其溶解，再加入NHS (1.6 g，0.0139 mol)、EDC (2.66 g,0.0139 mol)，在37 ℃水浴下攪拌活化6 h，轉速為360 rpm，接著加入2-Furfurylamine (1.35 g, 0.0139 mol)，繼續(xù)攪拌48 h。待反應結束后，透析24 h，以除去未反應的小分子物質。通過冷凍干燥得到絮狀物PAA-F。反應方程式見圖1(b)。

圖1 (a).PEI-M的合成；(b).PAA-F的合成Fig.1 (a).Synthesis of PEI-M；(b).Synthesis of PAA-F

2.4 基材表面處理

將1 cm×1 cm的不銹鋼片分別用去離子水、乙醇超聲清洗5 min，并用氮氣吹干。通過浸入食人魚溶液(H2SO4(95～97%)：H2O2(30%)= 7：3)中浸泡40 min使表面富羥基化，用去離子水清洗，氮氣吹干。將Dopa溶于50 mM Tris-HCl (PH= 8.5)中，濃度為4 mg / mL，將不銹鋼片浸入溶液中，37℃水浴，高速攪拌反應24 h，取出基板，用去離子水沖洗，氮氣吹干。獲得SS-PDA樣品。

2.5 PEI-M/PAA-F的層層自組裝

將PEI-M和PAA-F分別用去離子水溶解，濃度為1 mg/mL。然后將SS-PDA連續(xù)浸入PEI-M溶液和PAA-F溶液中10 min，獲得一個PEI-M/PAA-F雙層，重復10次后獲得SS-PDA-(PEI-M/ PAA-F)10樣品，簡寫為SS-PDA-L。將該樣品浸入去離子水中，37℃下進行Diels-Alder反應2 h，以獲得含氧降冰片烯結構。

2.6 抗菌聚合物的制備以及涂層接枝抗菌劑

制備含有雙硫鍵的抗菌聚合物聚(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化銨(PAMPTMA)[10]。接著將PAMPTMA(Mn = 27 000 g/mol，1 g，0.037 mmol)聚合物溶于50 mL THF中，通氮氣30 min后將DTT(0.077 g，0.5 mmol)加入Schlenk管中。將混合物在氮氣流保護下在50℃下攪拌24 h。將得到的AMPTMA-SH透析3 d，通過冷凍干燥分離產物(產率為95%)。

稱取50 mg產物，用去離子水配置濃度為3 mg/mL的溶液，再加入一定量的紫外光引發(fā)劑(IRGACURE 2959)。將表面沉積了多層聚電解質涂層的不銹鋼片浸入其中，在紫外光下(波長365 nm)照射15 min，將抗菌劑接枝在涂層表面，使不銹鋼表面獲得抗菌性能。獲得SS-PDA-L-AMPTMA樣品。反應方程式見圖2。

圖2點擊化學：Diels-Alder及硫醇-烯加成反應；R1:PAA, R2:PEI

Fig.2Click chemistry: Diels-Alder reaction and thiol-ene reaction；R1:PAA, R2:PEI

2.7 細胞毒性測試

將4種樣品(SS、SS-PDA、SS-PDA-L、SS-PDA-L-AMPTMA)浸入1X PBS溶液中24 h后，分別收集浸提液備用。取3～5代的成骨細胞，用胰酶將細胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來，用DMEM高糖培養(yǎng)液將細胞懸液的濃度調至5×104cell/ mL。然后在96孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL以及4種樣品的浸提液100 μL，以1X PBS為空白對照。在細胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁，然后加入20 μL 的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后將孔板中的液體除盡，接著每孔加入150 μL的 DMSO，振蕩10 min后，使用紫外分光光度計測量每孔的OD值。細胞存活率見式(1)：

(1)

2.8 抗菌性能測試

將4種樣品(SS、SS-PDA、SS-PDA-L、SS-PDA-L-AMPTMA)置于24孔板中紫外殺菌30 min。每孔中加入1 mL濃度為107CFU/ mL的S.aureus細菌懸液，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1、3、5 d，將不銹鋼片取出用無菌水輕輕沖洗3次，然后放入裝有10 mL無菌水的離心管中超聲30 min，接著吸1 mL液體加入到另一個裝有9 mL無菌水的離心管中進行稀釋，重復M次。從M個試管中分別吸取100 μL液體置于MH固體培養(yǎng)基上進行涂平板，取3個平行樣。將平板置于生化培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計菌落的個數(shù)N。E.coli的抗菌性能的測試方法同上。細菌濃度的計算見式(2)；以SS為對照組，抗菌率的計算見式(3)：

細菌濃度(CFU/mL)=N×10M+2

(2)

(3)

式中，C為對照樣細菌濃度；C′為不同樣品的細菌濃度。

3 結果與討論

3.1 聚合物的結構表征

通過紅外光譜圖3(a)中可以看到，與PEI相比，PEI-M在波數(shù)為3 480 cm-1處出現(xiàn)了N-H鍵的特征吸收峰；2 800 cm-1處為不飽和C-H鍵的特征吸收峰；在1 715 cm-1處出現(xiàn)了碳碳雙鍵的特征吸收峰；在1 637 cm-1處出現(xiàn)了C=O鍵的特征吸收峰；波數(shù)為1 175 cm-1處是脂肪環(huán)中C-N鍵的特征吸收峰；波數(shù)為768 cm-1處出現(xiàn)了五元環(huán)的特征吸收峰。核磁氫譜圖3(b)中，δ=5.0為位于a處的C-H,δ=5.9為位于b處的-CH2-,δ=6.25為位于c處的N-H,與結構式中氫位置相對應。

通過紅外圖譜圖3(c)可以看到，與PAA相比，PAA-F在波數(shù)為3 500 cm-1處出現(xiàn)了N-H的特征吸收峰；在波數(shù)為1 715 cm-1處，碳碳雙鍵的特征吸收峰增強；1 637 cm-1處出現(xiàn)了C=O的特征吸收峰；波數(shù)為1 250 cm-1處脂肪環(huán)中C-N鍵的特征吸收峰也增強。核磁氫譜圖3(d)中，δ=3.0為位于b處的-CH2，δ=5.5～6.7為位于c、d、e處的C-H，δ=7.4～8.0為位于a處的N-H，與結構式中各氫的位置相對應。

圖3(a).PEI和PEI-M的紅外光譜圖；(b).PEI和PEI-M的核磁氫譜圖；(c).PAA和PAA-F的紅外光譜圖；(d)PAA和PAA-F的核磁氫譜圖

Fig.3(a).FT-IR of PEI and PEI-M;(b).1HNMR of PEI and PEI-M;(c).FT-IR of PAA and PAA-F;(d).1HNMR of PAA and PAA-F

3.2 層層自組裝以及接枝抗菌劑的過程

由圖4(a)可以看出，PEI-M和PAA-F的親水性不同使得涂層表面水接觸角角度在(6.3°±0.8°)～(28.7°±1.4°)；從圖4(b)中觀察到多層膜的厚度在9層后，隨著層數(shù)的增加而近似線性增加，表明沉積過程穩(wěn)定。以上數(shù)據(jù)證明PEI-M和PAA

圖4P(EI-M)/P(AA-F)涂層隨聚電解質層數(shù)增加的關系圖(a).水接觸角；(b).膜厚-F在基材表面成功進行了層層自組裝。

Fig.4Graph of P(EI-M)/ P(AA-F) coating with increasing number of layers(a).Water contact angle;(b).Thickness

由圖5可以看到，涂層表面接枝了抗菌劑后，在1 715 cm-1處C=C的特征吸收峰減弱，而在1 093 cm-1處出現(xiàn)了C-S的特征吸收峰，說明表面抗菌劑成功接枝在涂層表面。

圖5 (a).SS-PDA-L的ATR-FTIR圖譜；(b).SS-PDA-L-AMPTMA的ATR-FTIR圖譜

Fig.5(a).ATR-FTIR of SS-PDA-L;(b).ATR-FTIR of SS-PDA-L-AMPTMA

3.3 涂層細胞毒性測試

由圖6可以看出，4種樣品對細胞均表現(xiàn)為無毒。SS-PDA-L由于涂層最外層為生物相容性較好的PAA聚電解質，細胞存活率較高，為105.5%；接枝了抗菌劑以后，細胞存活率提高到109.4%，說明將抗菌聚合物接枝到該涂層可以有效降低抗菌劑本身的生物毒性。

3.4 涂層的抗菌性能

為了研究各個涂層表面的抗菌性能，分別采用S.aureus和E.coli進行1、3、5 d的測試。為保持細菌的活性，沒有除去培養(yǎng)基，使該實驗處于細菌持續(xù)繁殖和抗菌劑持續(xù)殺菌的動態(tài)過程。以SS為對照組，從表1中我們可以看出，SS-PDA由于DOPA具有生物粘性，使得表面更容易粘附細菌，所以細菌濃度高于SS組，抗菌率一直為負；SS-PDA-L雖然表面沒有接枝抗菌劑，但憑借表面的超親水性，使得細菌無法輕易粘附在表面，隨著實驗天數(shù)的增加，涂層表面抗菌率變化不大，因為涂層表面只能抗細菌粘附，且已經達到飽和狀態(tài)；SS-PDA-L-AMPTMA的抗菌率最高，一方面利用表面的低表面能來抗細菌粘附，另一方面利用接枝的抗菌劑將粘附的細菌殺死，對S.aureus的抗菌率平均在90%，對E.coli的抗菌率則趨于99%，抗菌效果明顯。

圖6 樣品的細胞存活率(a).SS；(b).SS-PDA；(c).SS-PDA-L； (d).SS-PDA-L-AMPTMAFig.6 Cell viability (a).SS;(b).SS-PDA; (c).SS-PDA-L;(d).SS-PDA-L-AMPTMA表1 抗菌性能測試Table 1 Antibacterial performance test

細菌種類實驗天數(shù)(d)抗菌率(%)SS-PDASS-PDA-LSS-PDA-L-AMPTMA1-88.442.990.6S.aureus3-98.958.485.45-37.144.397.41-6.79299.1E.coli3-23.33598.65-10.668.598

4 結論

本研究以PEI和PAA為原料，分別在聚合物鏈上接枝馬來酰亞胺丙酸和糠胺小分子，再利用層層自組裝技術在不銹鋼基材表面沉積表面抗細菌粘附涂層，最后通過“巰基-烯”點擊反應在涂層表面接枝季銨鹽類抗菌劑，使自組裝涂層具有表面殺菌的能力。通過1HNMR、FT-IR、QCM以及水接觸角測試來表征所制備的聚合物結構。并以S.aureus、E.coli為對象進行抗菌測試，結果表明，通過層層自組裝技術制備的涂層在接枝抗菌聚合物后，既能抵抗細菌的粘附又殺死材料表面的細菌，抗菌性能得到大幅度提高，而且能持久殺滅細菌，在生物醫(yī)用材料表面抗菌功能化方面具有良好的應用前景。