β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克魯維酵母中的高效表達(dá)

唐詩(shī)涵， 李雪晴，袁風(fēng)嬌，李劍芳， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

內(nèi)切型 β-1，4-D-甘露聚糖酶 （endo-β-1，4-D-mannanase，EC 3.2.1.78）簡(jiǎn)稱(chēng) β-甘露聚糖酶，能特異性催化甘露聚糖分子主鏈β-1，4-D-糖苷鍵的水解，其產(chǎn)物為不同聚合度的甘露寡糖和少量單糖分子[1]。研究表明，甘露寡糖能有效促進(jìn)人與動(dòng)物腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌群的增殖，同時(shí)能抑制有害菌群的生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫力[2]。β-甘露聚糖酶廣泛存在于各種生物體尤其是微生物和植物中，在食品、飼料、醫(yī)藥、生物能源和紙漿漂白等工業(yè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[3]。

迄今為止，已有眾多β-甘露聚糖酶基因被克隆分析，并在多種表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，如畢赤酵母（Pichia pastoris）[4]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[5]、大腸桿菌（Escherichia coli）[6]、里氏木霉 （Trichoderma reesei）[7]和枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）[8]等體系。與畢赤酵母類(lèi)似，乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）具有生長(zhǎng)快、操作簡(jiǎn)便、分泌表達(dá)以及翻譯后加工準(zhǔn)確等特點(diǎn)。但畢赤酵母表達(dá)外源蛋白質(zhì)需要甲醇誘導(dǎo)，因此其表達(dá)的蛋白質(zhì)/酶存在一定的安全隱患；而乳酸克魯維酵母是被美國(guó)FDA認(rèn)證為 “一般認(rèn)為安全”（generally recognized as safe，GRAS）的菌種，其所用誘導(dǎo)劑為食品級(jí)原料（如半乳糖等），因此借助其表達(dá)的蛋白質(zhì)/酶可直接用于食品、飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域[9]。目前已有多種糖苷水解酶如α-淀粉酶、β-半乳糖苷酶和木聚糖酶等在乳酸克魯維酵母中進(jìn)行了表達(dá)[10]，但未見(jiàn)有β-甘露聚糖酶在乳酸克魯維酵母中表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道。

作者所在實(shí)驗(yàn)室前期將β-甘露聚糖酶基因Auman5A和突變基因Auman5Aloop/H321G分別在畢赤酵母GS115中成功實(shí)施了表達(dá)。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，突變酶AuMan5Aloop/H321G的溫度特性（Topt和t1/270）及其催化效率 （kcat/Km）較原酶AuMan5A均有顯著改善，分別達(dá)到 75 ℃、300 min 和 3 194 mL/（mg·s），具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。而經(jīng)畢赤酵母表達(dá)的AuMan5Aloop/H321G可能存在應(yīng)用領(lǐng)域受限等問(wèn)題，因此，本研究擬借助pKLAC1將Auman5Aloop/H321G在乳酸克魯維酵母GG799中表達(dá)，并對(duì)轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵產(chǎn)酶工藝進(jìn)行初步優(yōu)化，為食品級(jí)β-甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基

乳酸克魯維酵母GG799和表達(dá)質(zhì)粒pKLAC1：購(gòu)自美國(guó)New England BioLabs公司；克隆質(zhì)粒pUCm-T：購(gòu)自上海Sangon公司；大腸桿菌JM109和 DH5α：購(gòu)自 Novagen公司；重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Auman5Aloop/H321G：作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

LB、YCB、YPD和YPG培養(yǎng)基的配制：參照K.lactis Protein Expression Kit（New England BioLabs公司，2005版）操作手冊(cè)。

1.2 工具酶和試劑

ExTaq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、250 bp DNA Ladder Marker和低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker：均購(gòu)自大連TaKaRa公司；EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒：購(gòu)自上海Sangon公司；標(biāo)準(zhǔn)D-甘露糖和角豆膠：Sigma公司產(chǎn)品；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)表達(dá)質(zhì)粒pKLAC1多克隆位點(diǎn)和Kex酶切位點(diǎn)以及Auman5Aloop/H321G或Auman5A核苷酸序列（GenBank登錄號(hào)：HQ839639），設(shè)計(jì)一對(duì) PCR 引物Xho-F和Not-R，用于目的基因的擴(kuò)增；PCR引物IntPri-1、IntPri-2和IntPri-3，用于重組乳酸克魯維酵母的分析。所有引物由上海Sangon公司合成，見(jiàn)表1。

表1 目的基因擴(kuò)增和鑒定的PCR引物Table 1 PCR primers for the amplification and identification of Auman5Aloop/H321G

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以 pPICZαA-Auman5Aloop/H321G為模板、Xho-F 和Not-R為引物，PCR擴(kuò)增目的基因Auman5Aloop/H321G：94℃預(yù)變性4 min；30個(gè)循環(huán) （94℃ 30 s、55℃ 30 s和72℃ 70 s）；72℃延長(zhǎng)10 min。 將目的PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選、雙酶切鑒定和DNA測(cè)序。將測(cè)序正確的pUCm-T-Auman5Aloop/H321G經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，割膠回收目的條帶，與經(jīng)同樣雙酶切的pKLAC1連接，獲重組表達(dá)質(zhì)粒pKLAC1-Auman5Aloop/H321G，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 乳酸克魯維酵母轉(zhuǎn)化子的篩選和表達(dá)

pKLAC1和pKLAC1-Auman5Aloop/H321G經(jīng)SacⅠ線(xiàn)性化，分別電轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含5 mmol/L乙酰胺的YCB平板，30℃靜置培養(yǎng)3 d。隨機(jī)挑取生長(zhǎng)良好的單菌落，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)1.3～1.5時(shí)，提取菌體基因組DNA。參照K.lactis Protein Expression Kit操作手冊(cè)，以基因組DNA為模板，IntPri-1或IntPri-3和IntPri-2為上下游引物，PCR分析重組乳酸克魯維酵母，篩選出若干整合有多拷貝目的基因Auman5Aloop/H321G的轉(zhuǎn)化子；不含目的基因的轉(zhuǎn)化子命名為GG799/pKLAC1（空白對(duì)照）。將多拷貝轉(zhuǎn)化子和GG799/pKLAC1分別接種于YPD培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，以2%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接于30 mL YPG培養(yǎng)基中，在相同條件下誘導(dǎo)表達(dá)48 h，收集上清液測(cè)定β-甘露聚糖酶活性。選取成功表達(dá)reAuMan5Aloop/H321G且活性最高的乳酸克魯維酵母轉(zhuǎn)化子，命名為GG799/Auman5Aloop/H321G。

1.6 重組表達(dá)產(chǎn)物的分析

采用改良DNS法測(cè)定β-甘露聚糖酶活性。取2.4 mL、5 mg/mL 角豆膠溶液（用 pH 3.6、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制），65℃預(yù)熱10 min，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，65℃準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴顯色7 min，測(cè)定OD540。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖（以D-甘露糖計(jì)）所需酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。采用SDS-PAGE分析重組表達(dá)產(chǎn)物組成。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford法分析重組表達(dá)產(chǎn)物濃度。

1.7 發(fā)酵產(chǎn)酶工藝的初步優(yōu)化

1.7.1 誘導(dǎo)劑種類(lèi)對(duì)產(chǎn)酶的影響分別用20 mg/mL乳糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖替代YPG培養(yǎng)基中的半乳糖作為碳源和誘導(dǎo)劑，于30℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)96 h，取上清液測(cè)定β-甘露聚糖酶活性。

1.7.2 搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響在最適誘導(dǎo)劑條件下，將搖瓶的YPG裝液量分別調(diào)整為20、30、40、50、60、70 mL/250 mL，其它條件同 1.7.1。

1.7.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響在最適誘導(dǎo)劑和裝液量條件下，將YPG培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)整為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其它條件同 1.7.1。

1.7.4 誘導(dǎo)劑初始質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響在以上各種最適條件下，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的初始質(zhì)量濃度為20、40、80 mg/mL，每24小時(shí)取上清液測(cè)定β-甘露聚糖酶酶活性，其它條件同1.7.1。

1.7.5 誘導(dǎo)劑添加方式對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響在以上各種最適條件下，設(shè)計(jì)4種誘導(dǎo)劑添加方式：（A）誘導(dǎo)劑初始質(zhì)量濃度為40 mg/mL，后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中不補(bǔ)加誘導(dǎo)劑；（B）誘導(dǎo)劑初始質(zhì)量濃度為20 mg/mL，后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中不補(bǔ)加誘導(dǎo)劑；（C）誘導(dǎo)劑初始質(zhì)量濃度為40 mg/mL，每48小時(shí)補(bǔ)加誘導(dǎo)劑40 mg/mL；（D）誘導(dǎo)劑初始質(zhì)量濃度為20 mg/mL，每24小時(shí)補(bǔ)加誘導(dǎo)劑20 mg/mL。其中補(bǔ)加的誘導(dǎo)劑母液質(zhì)量濃度為400 mg/mL，在發(fā)酵過(guò)程中，每24小時(shí)取樣監(jiān)測(cè)酶活性、菌體生長(zhǎng)量和誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)pKLAC1多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn)，在上游引物Xho-F設(shè)計(jì)時(shí)引入了XhoⅠ位點(diǎn)和Kex切割信號(hào)肽α-MF的寡肽序列 （Lys-Arg）。 當(dāng)目的基因Auman5Aloop/H321G借助XhoⅠ和NotⅠ位點(diǎn)克隆至pKLAC1的α-MF下游時(shí)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及翻譯后加工，使表達(dá)產(chǎn)物reAuMan5Aloop/H321G擁有天然N末端，見(jiàn)圖1。根據(jù)1.4所述方法，將Auman5Aloop/H321G與pKLAC1連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨后提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，采用HindⅢ和NotⅠ雙酶切篩選重組質(zhì)粒。結(jié)果表明，空質(zhì)粒pKLAC1的雙酶切產(chǎn)物有一條約300 bp的特異性條帶；而重組質(zhì)粒pKLAC1-Auman5Aloop/H321G的產(chǎn)物有一條約1 400 bp的條帶，與預(yù)期相符。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pKLAC1-Auman5Aloop/H321G的構(gòu)建Fig.1 Construction of a recombinant expression plasmid pKLAC1-Auman5Aloop/H321G

2.2 重組乳酸克魯維酵母的構(gòu)建及篩選

pKLAC1和pKLAC1-Auman5Aloop/H321G經(jīng)線(xiàn)性化后，分別電轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含有乙酰胺的YCB平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，引物IntPri-1和IntPri-2進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出1.9 kb的片段，表明質(zhì)粒pKLAC1和pKLAC1-Auman5Aloop/H321G均已成功整合至乳酸克魯維酵母GG799基因組；引物IntPri-2和IntPri-3進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出2.3 kb的片段，表明乳酸克魯維酵母GG799基因組中的LAC4位點(diǎn)處整合有多拷貝串聯(lián)的表達(dá)框，未擴(kuò)增出2.3 kb片段轉(zhuǎn)化子為單拷貝子。挑取表達(dá)目的基因的多拷貝子，經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)和酶活性分析獲得產(chǎn)reAuMan5Aloop/H321G活性最高的轉(zhuǎn)化子GG799/Auman5Aloop/H321G，上清液酶活性為 54.9 U/mL，空白對(duì)照GG799/pKLAC1發(fā)酵上清液未檢測(cè)出β-甘露聚糖酶活性。結(jié)果表明，β-甘露聚糖酶基因Auman5Aloop/H321G成功在乳酸克魯維酵母GG799中表達(dá)。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)酶工藝的初步優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)劑種類(lèi)對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶的影響重組乳酸克魯維酵母可以利用多種誘導(dǎo)劑表達(dá)外源基因，誘導(dǎo)劑種類(lèi)對(duì)其生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酶有重要影響。如圖2（a）所示，以半乳糖為誘導(dǎo)劑時(shí)，GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)β-甘露聚糖酶活力最高。由于在缺少誘導(dǎo)物的情況下，啟動(dòng)子LAC4不會(huì)被完全抑制[11]，當(dāng)其以半乳糖外的還原糖甚至非還原糖作誘導(dǎo)劑，GG799/Auman5Aloop/H321G也能表達(dá)外源基因。其中以乳糖作誘導(dǎo)劑時(shí)，達(dá)到了半乳糖作誘導(dǎo)劑時(shí)的73.1%，以麥芽糖為誘導(dǎo)劑時(shí)僅為半乳糖的38.7%。故選擇半乳糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和誘導(dǎo)劑。

2.3.2 搖瓶裝液量對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶的影響乳酸克魯維酵母在生長(zhǎng)過(guò)程中耗氧，溶解氧濃度對(duì)其產(chǎn)酶有很大影響，在搖瓶發(fā)酵條件下，溶氧可以通過(guò)改變搖瓶的裝液量來(lái)調(diào)節(jié)。如圖2（b）所示，GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶的產(chǎn)酶活力隨著裝液量的增加而逐漸提高，當(dāng)裝液量達(dá)到70 mL/250 mL時(shí)，產(chǎn)酶活力降低。由于搖瓶發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)96 h，水蒸汽揮發(fā)影響培養(yǎng)基中各組分比例，裝液量過(guò)小會(huì)導(dǎo)致GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶活力較低；在搖瓶發(fā)酵后期，隨著乳酸克魯維酵母菌體的增加，耗氧量加大，當(dāng)裝液量的過(guò)高時(shí)溶氧量降低，從而影響GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶活力。當(dāng)裝液量為60 mL/250 mL時(shí)，GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶活力最高，故選取搖瓶裝液量為60 mL/250 mL。

圖2 誘導(dǎo)劑種類(lèi)、搖瓶裝液量以及培養(yǎng)基初始pH對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of inducers、medium volume and initial pH on the expression of GG799/Auman5Aloop/H321G

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)基pH主要從酶的活性、細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)、某些組分的解離以及代謝過(guò)程等方面影響酵母的生長(zhǎng)代謝和發(fā)酵產(chǎn)物合成[12]。由于搖瓶中培養(yǎng)基的pH不受控制，故只考慮培養(yǎng)基初始pH對(duì)重組乳酸克魯維酵母產(chǎn)酶活力的影響。由圖2（c）可知，GG799/Auman5Aloop/H321G對(duì)pH的耐受范圍較廣，在所選pH 5.0～7.5范圍內(nèi)，產(chǎn)酶活力幾乎不受影響，與王輝等[13]報(bào)道相符。培養(yǎng)基的自然pH在7.0左右，故選擇發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0。

2.3.4 誘導(dǎo)劑初始質(zhì)量濃度對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶的影響作為重組乳酸克魯維酵母的碳源和重組蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)劑，半乳糖的添加量對(duì)其生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酶有重要影響。如圖3所示，半乳糖初始質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶活力在48 h內(nèi)迅速增加，48 h后趨于平衡，最終產(chǎn)酶活力54.9 U/mL；半乳糖初始質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，產(chǎn)酶活力在72 h內(nèi)迅速增加，72 h后趨于平衡，最終產(chǎn)酶活力為70.2 U/mL，提高了27.8%；半乳糖初始質(zhì)量濃度為80 mg/mL時(shí)，產(chǎn)酶活力在24 h內(nèi)迅速增加，最終產(chǎn)酶活力僅為38.4 U/mL。結(jié)果表明，在發(fā)酵初期，產(chǎn)酶活力隨著菌體的增長(zhǎng)而迅速提高，發(fā)酵后期由于碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，產(chǎn)酶速率減緩。誘導(dǎo)劑初始質(zhì)量濃度影響GG799/Auman5Aloop/H321G的產(chǎn)酶活力。

圖3 半乳糖初始質(zhì)量濃度對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of initial concentration of galactose on the expression of GG799/Auman5Aloop/H321G

2.3.5 誘導(dǎo)劑添加方式對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響為進(jìn)一步優(yōu)化重組乳酸克魯維酵母搖瓶發(fā)酵工藝，按1.7.5方法設(shè)計(jì)4種誘導(dǎo)劑添加方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖4（a，b）所示，在未補(bǔ)加半乳糖的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液半乳糖質(zhì)量濃度在24 h內(nèi)分別從40 mg/mL和20 mg/mL迅速降低至2 mg/mL和1 mg/mL；其后，半乳糖維持在低質(zhì)量濃度水平，菌體濃度也趨于平衡，OD600最終為69.1（方式 A） >48.2（方式 B）。 如圖 4（c） 所示，當(dāng)每 48小時(shí)補(bǔ)加40 mg/mL半乳糖時(shí)，重組乳酸克魯維酵母細(xì)胞在24 h內(nèi)迅速增殖，48 h補(bǔ)加半乳糖后細(xì)胞繼續(xù)增殖，96 h后 OD600達(dá) 99.6，GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶活力平穩(wěn)上升，96 h后達(dá)到了96.1 U/mL，比未補(bǔ)加半乳糖方案A的70.2 U/mL提高了36.9%。如圖4（d）所示，在每24小時(shí)補(bǔ)加20 mg/mL半乳糖時(shí)，重組乳酸克魯維酵母菌體質(zhì)量濃度在96 h內(nèi)幾乎為線(xiàn)性增殖至OD600為91.5，與添加方式C相當(dāng)，GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶活力在48 h后大幅度上升，96 h后高達(dá)194.7 U/mL，比未優(yōu)化前提高254.6%，表明誘導(dǎo)劑少量多次的補(bǔ)料方式，可有效調(diào)節(jié)半乳糖作為碳源和誘導(dǎo)劑的作用方式[14]，從而調(diào)節(jié)重組乳酸克魯維酵母的生長(zhǎng)代謝和外源蛋白質(zhì)的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)β-甘露聚糖酶reAuMan5Aloop/H321G在乳酸克魯維酵母的高效表達(dá)。

圖4 半乳糖添加方式對(duì)GG799/Auman5Aloop/H321G菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of fed strategy of galactose on the growth and expression of GG799/Auman5Aloop/H321G

2.4 重組表達(dá)產(chǎn)物的分析

利用SDS-PAGE分析重組乳酸克魯維酵母的發(fā)酵上清液，GG799/Auman5Aloop/H321G的上清液在約55 000左右呈現(xiàn)一條特異性條帶，而GG799/pKLAC1無(wú)此蛋白質(zhì)條帶，進(jìn)一步說(shuō)明β-甘露聚糖酶基因Auman5Aloop/H321G通過(guò)乳酸克魯維酵母分泌表達(dá)。另外，優(yōu)化后的GG799/Auman5Aloop/H321G的表達(dá)水平較之前有明顯提升，見(jiàn)圖5。

優(yōu)化搖瓶發(fā)酵工藝后，GG799/Auman5Aloop/H321G發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶reAuMan5Aloop/H321G表達(dá)量為327.2 mg/L，為優(yōu)化前（87.4 mg/L）的 3.75倍，也高于表2中所報(bào)道重組乳酸克魯維酵母外源蛋白質(zhì)表達(dá)量。

圖5 重組β-甘露聚糖酶表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant β-mannanases

表2 重組乳酸克魯維酵母外源蛋白質(zhì)表達(dá)量Table 2 Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis

3 結(jié)語(yǔ)

將β-甘露聚糖酶突變體基因（Auman5Aloop/H321G）克隆至pKLAC1，并整合進(jìn)入乳酸克魯維酵母GG799，實(shí)現(xiàn)了其在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)。構(gòu)建得到的重組菌株GG799/Auman5Aloop/H321G的產(chǎn)β-甘露聚糖酶reAuMan5Aloop/H321G活力為54.9 U/mL。以半乳糖為最優(yōu)碳源和誘導(dǎo)劑，裝液量為60 mL/250 mL，初始pH為7.0，初始半乳糖質(zhì)量濃度為20 mg/mL，每24小時(shí)補(bǔ)加半乳糖至20 mg/mL的條件下，GG799/Auman5Aloop/H321G產(chǎn)酶活力達(dá)到194.7 U/mL，較優(yōu)化前提高了254.6%，蛋白質(zhì)表達(dá)量為327.2 mg/L，為優(yōu)化前的3.75倍。本研究成功實(shí)現(xiàn)了Auman5Aloop/H321G在乳酸克魯維酵母GG799中的高效異源表達(dá)，為制備食品、醫(yī)藥和飼料等加工領(lǐng)域的食品級(jí)β-甘露聚糖酶奠定了基礎(chǔ)。