給DNA甲基化檢測(cè)裝上GPS，看腫瘤細(xì)胞如何變花樣

徐鵬，于文強(qiáng)?

①上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； ②復(fù)旦大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

2019年1月22日，復(fù)旦大學(xué)于文強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室歷時(shí)8年研發(fā)的全基因組DNA甲基化檢測(cè)新方法“導(dǎo)向定位測(cè)序(guide positioning sequencing，GPS)”在線發(fā)表[1]，揭示了很多我們不曾想到的規(guī)律。開發(fā)全新的技術(shù)困難重重，個(gè)中辛酸難以言表。借著文章發(fā)表的契機(jī)，我們系統(tǒng)回顧了文章從想法到實(shí)現(xiàn)的歷程以及GPS所揭示的重要規(guī)律，希望為大家提供借鑒。

1 全基因組DNA甲基化檢測(cè)說起來容易做起來難

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)研究進(jìn)入了“后基因組時(shí)代”，而表觀遺傳學(xué)是“后基因組時(shí)代”的重要方向。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的核心組成部分，對(duì)于正常細(xì)胞功能維持、胚胎發(fā)育等生命過程至關(guān)重要，堪稱人類基因組的“另外一套密碼”。

對(duì)個(gè)體中的每種組織細(xì)胞而言，DNA幾乎相同，表觀基因組卻差異巨大，而且隨著時(shí)間的變化而不同。典型的例子就是通過檢測(cè)外周血中特定位置的DNA甲基化竟然可預(yù)測(cè)一個(gè)人的年齡[2]。異常的DNA甲基化與人類許多疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。因此，進(jìn)行全基因組DNA甲基化的精準(zhǔn)檢測(cè)和分析無疑對(duì)探索腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及開發(fā)新的抗腫瘤策略具有重要意義。

各國(guó)科學(xué)家紛紛行動(dòng)。2008年，美國(guó)NIH啟動(dòng)了“表觀基因組學(xué)路線圖計(jì)劃(Roadmap Epigenomics Project)”，計(jì)劃繪制正常細(xì)胞、人類胚胎干細(xì)胞等多種細(xì)胞的表觀基因組。2010年，國(guó)際人類表觀基因組聯(lián)盟(International Human Epigenome Consortium，IHEC)建立，旨在檢測(cè)250種細(xì)胞類型中的至少1 000個(gè)表觀基因組。

全基因組DNA甲基化測(cè)序是表觀遺傳領(lǐng)域公認(rèn)的“燒錢游戲”，而且由于比對(duì)率不夠高，造成大量的費(fèi)用浪費(fèi)。生物體基因組由A、T、C、G四種堿基構(gòu)成，當(dāng)DNA被重亞硫酸鹽處理后，未甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)門，構(gòu)成DNA的堿基只剩下A、T、G，其復(fù)雜度大幅度降低。測(cè)序完成后，大部分序列無法與人類參考基因組比對(duì)(map)，DNA甲基化計(jì)算無從談起，而確定重復(fù)序列區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)更是全基因組DNA甲基化檢測(cè)者的噩夢(mèng)。早期的全基因組DNA甲基化檢測(cè)的比對(duì)率不到30 %[3]。以30 %為例，可以理解為花費(fèi)的100元中只有30元有用，另外70元測(cè)到的序列因無法比對(duì)而被白白浪費(fèi)。與此同時(shí)，那70元檢測(cè)的序列其實(shí)是細(xì)胞內(nèi)真實(shí)存在的，只是因?yàn)榧夹g(shù)的限制被人為地忽略掉了，因此這種檢測(cè)最大的風(fēng)險(xiǎn)可能是“舍本逐末”。考慮到那70 %的真實(shí)信息可能也很重要，而當(dāng)只用30 %的DNA甲基化信息分析時(shí)，所得結(jié)論難免偏頗。

科學(xué)的進(jìn)步是循序漸進(jìn)的。2011年通過檢測(cè)大猩猩和人類各4份精子樣本的全基因組DNA甲基化即可以登上《細(xì)胞》雜志[4]?？上攵蚪MDNA甲基化檢測(cè)是多少人的夢(mèng)想，同時(shí)你也會(huì)覺察到，全基因組DNA甲基化檢測(cè)是“富人游戲”。因此，開發(fā)出人人可以負(fù)擔(dān)的全基因組DNA 甲基化檢測(cè)方法就顯得尤為重要。

2 GPS “因運(yùn)”而生

GPS方法開發(fā)純屬偶然。2009年的一天，于文強(qiáng)教授在尋找線粒體DNA甲基化信息時(shí)，發(fā)現(xiàn)幾乎無信息可用。線粒體DNA僅16 kb左右，而當(dāng)時(shí)已進(jìn)入二代測(cè)序時(shí)代，如果連一個(gè)16 kb的DNA都沒有甲基化信息，并不是因?yàn)榫€粒體DNA甲基化不重要，可能是全基因組DNA甲基化檢測(cè)存在問題，而這些問題無疑會(huì)阻礙該領(lǐng)域的發(fā)展。合理質(zhì)疑是解決問題的前提，而要解決一個(gè)問題，首先要弄清楚導(dǎo)致這個(gè)問題的根本原因。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，WGBS測(cè)序最主要的問題是序列比對(duì)率低和比對(duì)準(zhǔn)確性差。如果解決了這兩個(gè)問題，就很容易突破DNA甲基化檢測(cè)的瓶頸。

于文強(qiáng)教授在實(shí)驗(yàn)室下達(dá)了開展 DNA甲基化檢測(cè)召集令。首先，于文強(qiáng)教授將目前DNA甲基化檢測(cè)所有方法的優(yōu)缺點(diǎn)一一羅列，以供參考；然后，他提出如果有誰能夠提出全新的解決方案，實(shí)驗(yàn)室就會(huì)給予不同程度的獎(jiǎng)勵(lì)。為了攻克這個(gè)難題，同學(xué)們絞盡腦汁。既然DNA甲基化核心問題是比對(duì)率低，我們就將重心放在如何提高比對(duì)率和準(zhǔn)確性上。含有四個(gè)堿基的基因組比對(duì)沒有問題，我們何不借用雙端測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，讓雙端測(cè)序的一端是基因組原序列，另一端是轉(zhuǎn)化后的表觀序列，那問題不就迎刃而解了！我們將這種全基因組 DNA 甲基化檢測(cè)方法命名為GPS，即“導(dǎo)向定位測(cè)序”(圖1)。該方法目前已經(jīng)獲得國(guó)內(nèi)和國(guó)際專利。

策略一旦制定，就需要考慮如何實(shí)現(xiàn)這一設(shè)想。我們想到了T4 DNA聚合酶：在反應(yīng)體系中沒有dNTP的情況下，可發(fā)揮3' →5'外切酶的活性；當(dāng)有反應(yīng)體系中存在dNTP時(shí)，可發(fā)揮5' →3'聚合酶活性。不過在反應(yīng)體系中，我們將dCTP換成甲基化的dmCTP就可以了。這樣一來，所有的DNA片段3'端在重亞硫酸鹽處理后依然保持基因組序列，可用來定位，而5'端就可用來計(jì)算甲基化。我們大約用了一個(gè)月的時(shí)間證明這種策略可行，從而使復(fù)雜的全基因組DNA甲基化檢測(cè)兩大難題迎刃而解。

做研究的人都知道，要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)全新方法并讓它高效工作，談何容易。我們要確定酶的用量、酶切的時(shí)間、酶切的溫度，進(jìn)而對(duì)酶的活性進(jìn)行精準(zhǔn)把控。如果把握不好，要么就將DNA全切完了，要么切得很短，3'端無法定位。這期間我們想了好多辦法，難以把握一個(gè)精準(zhǔn)的度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果反復(fù)無常，時(shí)好時(shí)壞。歷經(jīng)艱辛把所有實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定下來后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析又成了大問題。由于沒有現(xiàn)成的軟件可以用，我們只好根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)自己編制分析軟件。大約用了3個(gè)月的時(shí)間，我們編制出第一版的軟件?？僧?dāng)比對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)200 G的數(shù)據(jù)需要計(jì)算機(jī)運(yùn)行3周，一般的實(shí)驗(yàn)室肯定吃不消。后來又編制了一版基于全新分析策略且需借助超級(jí)計(jì)算機(jī)的計(jì)算分析軟件，200 G的數(shù)據(jù)大約運(yùn)行3天，這解決了數(shù)據(jù)分析的大問題。但我們的本意是開發(fā)人人可用的技術(shù)，又有多少實(shí)驗(yàn)室可用超級(jí)計(jì)算機(jī)來分析DNA甲基化呢？于是我們?cè)俅尉幹屏艘话嫒碌能浖壳霸谄胀ㄓ?jì)算機(jī)上，200 G的數(shù)據(jù)運(yùn)行時(shí)間為3天左右。至此，GPS的實(shí)驗(yàn)條件和生物信息學(xué)分析軟件已全部?jī)?yōu)化好了。在GPS方法優(yōu)化過程中，不難看出一個(gè)全新方法的產(chǎn)生和成熟確實(shí)需要花費(fèi)很多的心思和精力，而這些難題我們都留給了自己。

3 GPS優(yōu)勢(shì)想得到，看得見

GPS 檢測(cè)全基因組DNA甲基化理論上簡(jiǎn)單，操作上易行，其優(yōu)勢(shì)不僅想得到，也看得見。

3.1 GPS檢測(cè) DNA甲基化的精確性

我們從人類參考基因組中隨機(jī)生成了100 萬個(gè)雙端測(cè)序讀長(zhǎng)并進(jìn)行相應(yīng)的改變，以模擬雙端測(cè)序結(jié)果。由于已知這些片段確切的基因組位置，我們可以通過GPS策略計(jì)算它們精確比對(duì)的概率，進(jìn)而評(píng)估GPS檢測(cè)DNA甲基化的準(zhǔn)確性。如果使用BSMAP進(jìn)行序列比對(duì)，其比對(duì)率僅為66.2 %，而GPS 的比對(duì)率高達(dá)82.3 %，接近于用Bowtie2進(jìn)行基因組的比對(duì)率——86.3 %。在后續(xù)具體的實(shí)際測(cè)序和分析中，我們用焦磷酸測(cè)序?qū)嶒?yàn)也證明GPS具有極高的準(zhǔn)確性，證明GPS具有精準(zhǔn)檢測(cè)的先天優(yōu)勢(shì)(圖2)。

3.2 GPS 具有較高的比對(duì)率

在對(duì)肝細(xì)胞實(shí)際檢測(cè)中，GPS比對(duì)率為 80.9 %，比WGBS 的比對(duì)率高15 %～20 %，這主要是WGBS數(shù)據(jù)的原理上的復(fù)雜度降低所致。在人類參考基因組中DNA雙鏈中有1 170 378 405個(gè)胞嘧啶(C)位點(diǎn)，以及56 434 896個(gè)CpG位點(diǎn)。以目前常用的基因芯片檢測(cè)方法為例，如450 K或850 K芯片，能夠檢測(cè)到的甲基化位點(diǎn)僅為45萬個(gè)或85萬個(gè)，占到人體基因組全部CpG的0.8 %~1.5 %，占全部胞嘧啶的0.04 %~0.07 %，而RRBS能夠檢測(cè)的CpG位點(diǎn)約為1 %。WGBS通常能夠覆蓋全部CpG位點(diǎn)的90 %左右，認(rèn)為可以用來準(zhǔn)確評(píng)估樣本的DNA甲基化狀態(tài)。在肝細(xì)胞中，GPS覆蓋到了54 853 393個(gè)CpG位點(diǎn)，覆蓋率高達(dá)97 %，同時(shí)也覆蓋到了1 123 233 333個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)，覆蓋率為96 %。從嚴(yán)格意義上來講，只有全部確定了人體基因組中每一個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)才能算是繪制了人體細(xì)胞的表觀基因組完整圖譜，我們認(rèn)為，GPS為我們繪制了第一張人類肝細(xì)胞的表觀基因組圖譜(至少是最接近)。

圖1 導(dǎo)向定位測(cè)序(guide positioning sequencing，GPS)工作原理[1]

圖2 GPS比WGBS具有更高的比對(duì)率[1]

3.3 GPS甲基化檢測(cè)成本低

GPS甲基化檢測(cè)成本低主要基于GPS的高比對(duì)率，同時(shí)GPS測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)只要超過5層就能夠比較精準(zhǔn)地計(jì)算出DNA甲基化。而WGBS精準(zhǔn)檢測(cè)甲基化一般情況下需要超過30層。目前GPS對(duì)一個(gè)樣本的檢測(cè)大約需要200 G的測(cè)序數(shù)據(jù)，在10×Genomics測(cè)序平臺(tái)上大約相當(dāng)于兩條lane的測(cè)序數(shù)據(jù)，測(cè)序成本在1.5萬元左右，況且可以同時(shí)獲得基因組和表觀基因組數(shù)據(jù)。

3.4 GPS 檢測(cè)甲基化沒有序列偏好性

通過比較GPS測(cè)序和人類基因組功能區(qū)的分布情況，很清楚地看到，GPS 檢測(cè)到的DNA甲基化位點(diǎn)在啟動(dòng)子區(qū)域和功能基因組元件上沒有分布偏好性。與WGBS相比，GPS對(duì)于重復(fù)序列、CpG島以及富含GC(GC-rich)區(qū)域(如啟動(dòng)子區(qū)域)的檢測(cè)具有更高的效率(圖3)。這些優(yōu)勢(shì)對(duì)全基因組的DNA甲基化精準(zhǔn)檢測(cè)非常重要，可有效避免測(cè)序偏差導(dǎo)致結(jié)論的不確定性。例如，腫瘤細(xì)胞存在全基因組的DNA低甲基化現(xiàn)象，而偏偏WGBS傾向于檢測(cè)DNA的高甲基化區(qū)域，因此依靠WGBS來評(píng)估腫瘤細(xì)胞的全基因組DNA甲基化狀態(tài)就會(huì)高估腫瘤細(xì)胞DNA實(shí)際的甲基化水平。我們的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)(圖3)。

圖3 GPS在全基因組范圍的覆蓋無偏好性，可覆蓋重復(fù)序列和富含GC區(qū)域[1]

3.5 GPS 可以同時(shí)檢測(cè)表觀基因組和基因組學(xué)變異

GPS特別適用于精準(zhǔn)檢測(cè)等位基因特異性的甲基化(allele-specific methylation，ASM)，而ASM檢測(cè)有助于回答許多表觀遺傳調(diào)控的關(guān)鍵的基礎(chǔ)問題。例如，使用相同的數(shù)據(jù)量，GPS鑒定了1 820個(gè)ASM，而WGBS只鑒定了135個(gè)。我們也驗(yàn)證了97 L細(xì)胞系中的兩個(gè)ASM，它們定位于CCDC97和TOP1MT基因，這些區(qū)域富含轉(zhuǎn)錄因子和DNaseI高敏感位點(diǎn)。因此， GPS更適用于研究基因組和表觀基因組之間的交互作用(crosstalk)，而以前這些問題很難研究清楚。

4 MeGDP：DNA甲基化調(diào)控“相反相成”

眾所周知，DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)?；騿?dòng)子區(qū)域的甲基化高，基因表達(dá)降低；啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化低，則基因表達(dá)升高。這種調(diào)控規(guī)律深入人心。但如果將一種特定組織細(xì)胞中所有啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與全部表達(dá)基因進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)二者并沒有顯著相關(guān)性，這意味著局部的規(guī)律性并不能代表整體的規(guī)律性。此外，某些基因的啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化并不意味著該基因表達(dá)一定降低，即有些基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，這個(gè)基因反而高表達(dá)。由此可見，DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控并非我們想象的那么簡(jiǎn)單。后來，全基因組DNA甲基化的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，基因體的甲基化與啟動(dòng)子區(qū)域正好相反，即基因體的高甲基化與基因的高表達(dá)有關(guān)，反之亦反(圖4)。GPS檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，這種規(guī)律也并不總是對(duì)的。例如，基因表達(dá)FPKM值超過20時(shí)，基因體DNA甲基化不再與基因表達(dá)正相關(guān)。結(jié)果顯示，F(xiàn)PKM值超過20的基因，其基因體甲基化程度更低，長(zhǎng)度更短，更為保守，而且主要富集在代謝通路上。

那么問題隨之而來，啟動(dòng)子和基因體DNA甲基化為何會(huì)有截然相反的調(diào)控規(guī)律，它們之間是否存在內(nèi)在的聯(lián)系并共同調(diào)控基因的表達(dá)？能否僅僅通過DNA甲基化檢測(cè)來精準(zhǔn)預(yù)測(cè)基因的表達(dá)情況，而這一點(diǎn)對(duì)于評(píng)估某些感興趣的基因在特殊樣本(如石蠟樣本)中的表達(dá)具有重要意義。

鑒于GPS檢測(cè)每一個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化的精準(zhǔn)性，當(dāng)我們用基因體和啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化差值(MeGDP, methylation of genebody difference to promoter)與基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí)，驚喜地發(fā)現(xiàn)MeGDP與基因表達(dá)之間的相關(guān)性高達(dá)0.67，提示MeGDP可以用來預(yù)測(cè)基因表達(dá)的情況(圖5)。如果利用WGBS測(cè)到的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得到相關(guān)系數(shù)僅為0.33。在其他樣本中應(yīng)用GPS，也能得到類似的結(jié)果，而WGBS結(jié)果則毫無規(guī)律性可言。由此可見，MeGDP的發(fā)現(xiàn)得益于GPS對(duì)甲基化的精準(zhǔn)檢測(cè)。

圖4 基因表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)域以及基因體DNA甲基化有關(guān)[1]

5 MeGDP：腫瘤免疫新框架和新靶標(biāo)

切勿低估MeGDP，除了用于特殊樣本中基因表達(dá)的預(yù)測(cè)，其重要性遠(yuǎn)不止于此。腫瘤的發(fā)生與免疫功能紊亂以及代謝異常密切相關(guān)，但表觀遺傳因素發(fā)揮了什么作用還有待探究。在肝癌細(xì)胞中，因MeGDP降低導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)的基因主要富集在免疫與刺激反應(yīng)以及代謝途徑相關(guān)基因，而且P值非常低。由此可見，MeGDP可以更好地用來研究腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控與腫瘤各種生物學(xué)行為的關(guān)系。

圖5 MeGDP、H3K4me3和H3K36me3與基因表達(dá)均存在很強(qiáng)相關(guān)性

眾所周知，腫瘤發(fā)生與免疫系統(tǒng)紊亂有極大的關(guān)系，免疫監(jiān)視系統(tǒng)失衡是腫瘤發(fā)生的重要原因。腫瘤與免疫監(jiān)視系統(tǒng)的相互作用(tumorimmune surveillance network)包含兩層意思：其一是腫瘤細(xì)胞自身，其二是人體的免疫系統(tǒng)。但目前為止腫瘤如何逃避免疫系統(tǒng)還是一個(gè)謎。一般認(rèn)為，腫瘤與免疫監(jiān)視系統(tǒng)相互作用的重點(diǎn)是免疫系統(tǒng)，即腫瘤中的各種淋巴細(xì)胞異常，如火熱的免疫治療正是針對(duì)這些“不作為”的免疫細(xì)胞。近來有些研究去尋找腫瘤新生抗原(如Neoantigen)，理論眾多，但實(shí)際應(yīng)用的并不多。因此有必要重新認(rèn)識(shí)并深入理解腫瘤免疫，尤其是從腫瘤細(xì)胞自身來重新詮釋腫瘤免疫。從表觀遺傳的角度，任何細(xì)胞都可能具有免疫細(xì)胞的特性，因此腫瘤細(xì)胞自身免疫相關(guān)基因的調(diào)控也是腫瘤免疫調(diào)控的重要組成部分。換言之，對(duì)于腫瘤免疫，我們不僅要關(guān)注免疫系統(tǒng)，更需要關(guān)注腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的天然免疫系統(tǒng)基因的調(diào)控，而腫瘤細(xì)胞中內(nèi)在的免疫相關(guān)基因的甲基化異常導(dǎo)致的基因沉默也許是腫瘤免疫逃逸的重要原因。

我們的研究結(jié)果表明，由于MeGDP導(dǎo)致的甲基化異常，腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性的免疫相關(guān)基因被異常甲基化所沉默，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)外界的各種治療或免疫治療沒有反應(yīng)。據(jù)此，我們推測(cè)，腫瘤的免疫耐受與免疫系統(tǒng)中的淋巴細(xì)胞可能沒有必然的關(guān)系，而由腫瘤細(xì)胞自身的表觀遺傳學(xué)異常這個(gè)內(nèi)因決定。在這個(gè)新的腫瘤免疫框架下，尋找預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療的新靶標(biāo)可能會(huì)出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)機(jī)。

目前PD-1/PD-L1抗體治療的大量腫瘤患者沒有顯著效果，沒有人愿意成為其中的一員。擺在臨床醫(yī)生和廣大患者面前的一個(gè)重要且迫切的需求就是找出一個(gè)能夠預(yù)測(cè)PD-1治療有效性的標(biāo)志物。現(xiàn)在已經(jīng)存在一些標(biāo)志物，比如PD-L1的表達(dá)量[5]，可是在臨床的驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)它并不好用。有研究認(rèn)為腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)不錯(cuò)[6]，但TMB并不是免疫治療特有預(yù)測(cè)標(biāo)志物，也可以預(yù)測(cè)其他治療方案的效果。總之，目前的預(yù)測(cè)免疫治療的有效標(biāo)志物并不理想。在黑色素瘤病人中，免疫監(jiān)控相關(guān)的干擾素IFNG通路基因的突變或拷貝數(shù)丟失使得抗-CALA4反應(yīng)失效[7]。遺憾的是，IFN通路上60多個(gè)基因突變的概率太低，雖然很有意義，但臨床應(yīng)用十分困難。借助GPS，我們對(duì)IFN 通路60多個(gè)基因的MeGDP與基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)MeGDP異常在肝癌細(xì)胞中確實(shí)可以導(dǎo)致 IFN 通路中的大多數(shù)基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而可能用于PD-1治療效果的預(yù)測(cè)。如果想進(jìn)一步破解PD-1治療不佳的魔咒，我們認(rèn)為DNA甲基化抑制劑可能派得上用場(chǎng)，而且已有研究證明，5-AZA(5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶，一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑)確實(shí)與腫瘤細(xì)胞自身的免疫激活有關(guān)。我們也發(fā)現(xiàn)，在5-AZA處理后，免疫相關(guān)基因EDNRB、ACP5以及BST2都上調(diào)2~75倍。此外，我們也有理由推測(cè)肝癌細(xì)胞中的MeGDP的異常模式導(dǎo)致的免疫相關(guān)基因沉默是目前肝癌藥物和其他療法不佳的重要因素。

6 MBS：DNA甲基化調(diào)控不僅需要高度，更需要廣度

MBS的發(fā)現(xiàn)和定義純屬偶然。MBS即methylation boundary shift，意為甲基化邊界漂移。談到DNA甲基化對(duì)基因的調(diào)控，我們大多關(guān)注DNA甲基化高和低，因?yàn)檫@直接決定了基因表達(dá)的低與高。然而，當(dāng)我們將正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組后，在UCSC genome browser站點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中以TSS為中心的啟動(dòng)子區(qū)域DNA低甲基化范圍在大多數(shù)情況下總是顯示出更廣闊的“V”字形模式(wider opening)。這是巧合還是規(guī)律？我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)子區(qū)域確實(shí)存在甲基化邊界的漂移(圖6左)。如圖所示，MBS現(xiàn)象在腫瘤細(xì)胞中非常清楚。MBS在腫瘤細(xì)胞中的出現(xiàn)，會(huì)有怎樣的生物學(xué)功能呢？

6.1 MBS與組蛋白修飾的關(guān)系

MBS所在區(qū)域與H3K4me3高度重疊，但MBS與H3K36me3富集是互斥的(圖6右)。

圖6 97L細(xì)胞中MBS、H3K4me3和H3K36me3的分布[1]

6.2 MBS與基因表達(dá)有關(guān)

我們的結(jié)果表明MBS向基因體方向的漂移與基因的高表達(dá)密切關(guān)聯(lián)(圖7左)。MYC基因就是一個(gè)典型的例子。腫瘤細(xì)胞中MYC基因高表達(dá)，但其調(diào)控機(jī)制很多，而在這里清楚地看到MYC基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在顯著的甲基化邊界漂移(圖7中)，而且這種甲基化邊界漂移模式與H3K4me3的峰長(zhǎng)相一致(圖7右)，說明MBS至少在一定程度上與腫瘤細(xì)胞中MYC基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

既然MBS與基因表達(dá)有關(guān)，那么MBS是否與腫瘤的發(fā)生相關(guān)呢？通過對(duì)肝癌細(xì)胞中異常的MBS模式及相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些基因富集在核糖體和細(xì)胞周期相關(guān)的通路。白血病細(xì)胞與正常造血祖細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定，很重要的一條標(biāo)準(zhǔn)就是細(xì)胞核中核仁的數(shù)量。核仁數(shù)量越多，是白血病細(xì)胞的可能性就越高，而核仁的增多離不開核糖體相關(guān)基因的高表達(dá)。如果按照傳統(tǒng)的甲基化調(diào)控理論，可能會(huì)認(rèn)為rRNA基因不受表觀遺傳學(xué)調(diào)控，因?yàn)樗衦RNA基因的啟動(dòng)子均是低甲基化。而MBS揭示，DNA甲基化的邊界漂移與腫瘤中rRNA的高表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在60多個(gè)核糖體相關(guān)基因中，有48個(gè)核糖體基因的表達(dá)調(diào)控與MBS相關(guān)，而應(yīng)用WGBS只發(fā)現(xiàn)了7個(gè)，再一次印證了GPS檢測(cè)甲基化的精準(zhǔn)性?？梢韵胂螅绻谆臋z測(cè)準(zhǔn)確性存疑，甲基化邊界的漂移鑒定就變成了一項(xiàng)不可能完成的任務(wù)。哪怕比較幸運(yùn)，偶爾在WGBS數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了MBS，但因?yàn)樵谙乱粋€(gè)樣本中沒法重復(fù)，也很難得到規(guī)律性的結(jié)論。我們?cè)趦蓚€(gè)乳腺細(xì)胞系MCF-10A以及MCF-10A-1H中進(jìn)行GPS測(cè)序，同樣發(fā)現(xiàn)MBS及相似的調(diào)控規(guī)律，說明MBS調(diào)控具有普遍性。

圖7 MBS與基因表達(dá)的相關(guān)性[1]

7 MBS：增強(qiáng)子與細(xì)胞身份“得”與“失”

人類基因組中有數(shù)百萬的增強(qiáng)子元件，其中H3K27ac是活性增強(qiáng)子的標(biāo)簽。既然啟動(dòng)子區(qū)域存在明顯的MBS，我們自然會(huì)想到，作為與啟動(dòng)子類似的順式調(diào)控元件，增強(qiáng)子是否也受到MBS的調(diào)控。我們的答案是肯定的。在肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中，H3K27ac的峰寬也與MBS高度重疊(圖8左)，提示MBS與H3K27ac具有相關(guān)性，進(jìn)而對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生影響。與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞的MBS發(fā)生了顯著的變化，進(jìn)而引起增強(qiáng)子活性的選擇性丟失或重新獲得，這些增強(qiáng)子變化可導(dǎo)致相應(yīng)的基因表達(dá)發(fā)生變化。我們驚訝地看到許多基因與細(xì)胞的身份相關(guān)，如肺發(fā)育、免疫細(xì)胞激活或其他組織特異性的基因。因此有理由相信，正是由于MBS異常模式導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)子邊界和活性變化，進(jìn)而促使組織特異性基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，引起細(xì)胞身份的得與失，而這一切也許在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中與腫瘤細(xì)胞特性的形成密切相關(guān)。

8 腫瘤轉(zhuǎn)移，也許就是腫瘤細(xì)胞身份轉(zhuǎn)變

轉(zhuǎn)移是晚期腫瘤的顯著特征，關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移的假說層出不窮，主要包含腫瘤干細(xì)胞理論、腫瘤微環(huán)境理論、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化理論、“種子—土壤”學(xué)說等10種。經(jīng)驗(yàn)告訴我們，對(duì)于絕大多數(shù)腫瘤而言，一旦轉(zhuǎn)移，留給患者的時(shí)間就不多了。到目前為止，腫瘤轉(zhuǎn)移的研究還停留在“假說”階段。換句話說，假說依然是“假”的，并沒有被證實(shí)，所以我們對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移依然束手無策。

“同化共生”(assimilated symbiosis)，是我們基于我們的研究結(jié)果提出的有關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)新概念。腫瘤細(xì)胞通過改變身份與特異性轉(zhuǎn)移的器官相互適應(yīng)，進(jìn)而在轉(zhuǎn)移的組織器官中與新的環(huán)境“同化共生”，可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。物以類聚，人以群分，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也一樣。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的重要原因之一，而腫瘤特異性的器官轉(zhuǎn)移機(jī)制并不清楚。例如，肝癌容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，通過分析肝癌細(xì)胞97L和肝癌特異性轉(zhuǎn)移到肺的LM3細(xì)胞的DNA甲基化模式和基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞特異性的基因表達(dá)顯著降低(圖9左)，而肺細(xì)胞特異性的基因表達(dá)上調(diào)(圖9中)。我們認(rèn)為肝細(xì)胞身份丟失和肺細(xì)胞身份的獲得是肝癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的重要原因。在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中，伴隨異常的DNA甲基化介導(dǎo)的細(xì)胞身份的丟失和獲得，使肺特異性基因表達(dá)增加，從而使肝癌細(xì)胞獲得了肺細(xì)胞的身份，這有助于肝癌細(xì)胞在肺的環(huán)境中適應(yīng)和生存，而這也許是腫瘤轉(zhuǎn)移最重要的原因。簡(jiǎn)單地說，就是細(xì)胞換了個(gè)“馬甲”，從而實(shí)現(xiàn)了“同化共生”。

圖8 增強(qiáng)子與MBS具有一致性

圖9 肝癌發(fā)生過程中細(xì)胞身份的丟失[1]

和我們預(yù)想的一樣，在97L和LM3肝癌細(xì)胞系中，肝特異性高表達(dá)的基因的數(shù)目分別降低了74 %和80 %。例如：一方面，在97L和LM3細(xì)胞中，肝特異性基因ONECUT2表達(dá)沉默，這與H3K27ac峰的丟失以及肝特異性增強(qiáng)子區(qū)域DNA甲基化的增加相一致(圖10左)；另一方面，在97L和LM3中觀察到肺特異性基因CKS2的表達(dá)升高，這與H3K27ac峰的升高以及肺特異性增強(qiáng)子中DNA甲基化的降低相一致(圖10右)。在LM3中肺特異性的基因的表達(dá)可以幫助它們更好地在肺環(huán)境中適應(yīng)和生存，即實(shí)現(xiàn)了“同化共生”，而腫瘤細(xì)胞身份的丟失以及其他細(xì)胞身份的獲得是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提條件和重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

圖10 肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中肝/肺特異性基因的表達(dá)變化[1]

“同化共生”背后的表觀遺傳因素可能是腫瘤發(fā)生特異性器官轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制，這為我們理解腫瘤轉(zhuǎn)移提供了全新的視角。