生物轉(zhuǎn)化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的關(guān)鍵因素

朱德強(qiáng)，詹曉北，吳劍榮，鄭志永，趙忠勝，王永遠(yuǎn)

（江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

唾液酸（Sialic acid）是一類(lèi)含有9個(gè)碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，又稱(chēng)為神經(jīng)氨酸，系統(tǒng)名為5-氨基-3，5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。唾液酸最初是由Blix和KlenK從頜下腺粘蛋白和腦糖脂中提取出來(lái)的，隨著3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖（KDN）的發(fā)現(xiàn)，唾液酸的定義得到拓展，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了50多種[1]。唾液酸在自然界中分布廣泛，多發(fā)現(xiàn)于后口動(dòng)物及某些細(xì)菌中。唾液酸常常占據(jù)細(xì)胞膜表面糖鏈的末端，在細(xì)胞粘附、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分化等生理活動(dòng)中起到重要作用[2]。N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）是最常見(jiàn)的一種唾液酸，也是多種唾液酸合成的前體物質(zhì)，與人類(lèi)健康關(guān)系密切[3]；Neu5Ac還是抗病毒藥物的潛在前體物質(zhì)，用于治療H1N1和H5N1流感。此外，Neu5Ac也有很大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，它能促進(jìn)嬰兒的大腦發(fā)育，對(duì)維持早產(chǎn)兒腦功能和健康有積極作用[4]。

在前期的研究中，我們構(gòu)建了一株重組大腸桿菌（E.coliSA-04/pDTrc-AB），通過(guò)將GlcNAc-2-epimerase（bAGE）[5-6]和 sialic acid synthase（cNeuB）[7-8]的共表達(dá)、GlcNAc跨膜運(yùn)輸系統(tǒng)的修飾以及Neu5Ac分解代謝途徑的敲除，使得該重組大腸桿菌能夠以胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）為能量來(lái)源，以GlcNAc為單一底物，生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac；同時(shí)，避免了傳統(tǒng)細(xì)胞催化合成Neu5Ac需要大量丙酮酸（pyruvate）的缺陷，具有很大經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好優(yōu)勢(shì)。

在該重組大腸桿菌的培養(yǎng)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)菌體大量生長(zhǎng)，胞內(nèi)酶活性保持較高水平，而Neu5Ac合成產(chǎn)率卻較低。因此，本研究以重組大腸桿菌E.coliSA-04/pDTrc-AB為對(duì)象，考察生物轉(zhuǎn)化環(huán)境中的碳源和氮源對(duì)重組大腸桿菌生理和Neu5Ac合成的影響，探討Neu5Ac合成過(guò)程中的內(nèi)在關(guān)鍵限制性因素，以期實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌高效快速合成Neu5Ac。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

重組大腸桿菌E.coliSA-04/pDTrc-AB由本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建：以E.coliK-12 MG1655為出發(fā)菌株，敲除其基因組中的nagE基因和manXYZ、nanATEK基因簇，并將來(lái)源于Campylobacter jejuniNCTC 11168中的neuB基因（cneuB）和源于Anabaenasp.CH1的 AGE基因（bage）克隆到pTrcc99a載體，分別加上trc啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了2個(gè)基因在大腸桿菌中的共表達(dá)。

Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；其他試劑購(gòu)自上海國(guó)藥。

1.2 生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac流程

雙階段生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac流程見(jiàn)圖1。菌體生長(zhǎng)階段，待細(xì)胞濃度上升后添加誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)胞內(nèi)酶的表達(dá)；生物轉(zhuǎn)化階段，將菌體收集濃縮后懸浮于添加了底物GlcNAc的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，同時(shí)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中含有必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持細(xì)胞活性。

圖1 全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac流程圖Fig.1 Flow chart of whole-cell synthesis of Neu5Ac

1.2.1 菌體生長(zhǎng)階段 在菌體生長(zhǎng)階段，所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，氯化鈉 10 g/L，pH 7.0），添加氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度 100 mg/L），接種于500 mL搖瓶中，置于37℃搖床（200 r/min）中培養(yǎng)大約3 h，當(dāng)OD600達(dá)到1.2時(shí)，添加異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.2 mmol/L。繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h后，將菌液收集于冰浴中靜置10 min，然后低溫（4 ℃）8000×g離心 15 min，棄掉上清液，用預(yù)冷的生理鹽水洗滌菌體2次，待用。

1.2.2 生物轉(zhuǎn)化階段 將收集到的菌體重新懸浮于50 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（OD600=15），轉(zhuǎn)移至500 mL擋板搖瓶，補(bǔ)加IPTG至終濃度0.2 mmol/L，于37℃搖床200 r/min培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分為葡萄糖70 g/L或 甘 油 15 g/L，GlcNAc 80 g/L，MgSO41.2 g/L，K2HPO4·3H2O 25.0 g/L，氮源見(jiàn)表 1，pH 7.0。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量測(cè)定方法 通過(guò)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值來(lái)測(cè)定生物量。重組大腸桿菌的干質(zhì)量與吸光度值的換算關(guān)系是：1.0 OD600=0.382 g/L細(xì)胞干質(zhì)量。

1.3.2 蛋白質(zhì)測(cè)定方法 采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[9]測(cè)定，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)繪制擬合曲線。

1.3.3 Neu5Ac測(cè)定方法 Neu5Ac通過(guò)高效液相色譜（島津LC2010a）測(cè)定。所用色譜柱為伯樂(lè)公司的 Aminex HPX-87H column（300 mm × 7.8 mm），柱溫為35℃，流動(dòng)相為5.0 mmol/L硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，使用UV檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)是196 nm。1.3.4 NeuB活性測(cè)定方法 在前期的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)AGE的活性遠(yuǎn)高于NeuB，因此NeuB的活性大小對(duì)Neu5Ac的合成具有更大的影響；于是在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們重點(diǎn)關(guān)注NeuB的活性，其測(cè)定方法如下：將發(fā)酵液樣品低溫（4℃）離心（10000g，5 min），棄掉上清液后，用預(yù)冷的生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于生理鹽水中，超聲波破碎（破碎時(shí)間：4 s；暫停時(shí)間：10 s；共計(jì)時(shí)間：20 min），低溫離心，收集上清作為粗酶液。

NeuB活性以ManNAc向Neu5Ac的轉(zhuǎn)化速率來(lái)定義。酶活測(cè)定體系（1.0 mL）為T(mén)ris-HCl 0.1 mol/L pH 7.0，10 mmol/L MnSO4，50 mmol/L ManNAc，50 mmol/L PEP，添加20 μL酶液。將反應(yīng)體系置于37℃水浴20 min后，沸水浴10 min終止反應(yīng)。1 min內(nèi)催化合成1 nmol Neu5Ac所需的酶量定義為1 U。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙階段生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac過(guò)程

菌體生長(zhǎng)階段，在IPTG的誘導(dǎo)下，源于Anabaenasp.CH1的 AGE基因（bage）和源于C.jejuniNCTC 11168中的neuB（cneuB）在重組大腸桿菌中共表達(dá)。在生物轉(zhuǎn)化階段，外源的GlcNAc在bAGE的催化下，異構(gòu)化形成ManNAc；繼而在cNeuB 的催化下，與胞內(nèi)的 PEP 合成 Neu5Ac[8，10]。在此生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，不需過(guò)量的外源丙酮酸（pyruvate）供給；但需要消耗胞內(nèi)的PEP。為提高生物轉(zhuǎn)化階段的菌體活性，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加GlcNAc作為生物轉(zhuǎn)化階段的培養(yǎng)基（標(biāo)記為L(zhǎng)B+培養(yǎng)基，如表 1所示），過(guò)程曲線見(jiàn)圖 2（a）。

在生物轉(zhuǎn)化階段的初始階段，生物量和胞內(nèi)NeuB活性經(jīng)歷一個(gè)短暫且迅速的下降。這可能是由于在菌體收集與洗滌過(guò)程中，在剪切力的影響下，部分細(xì)胞的細(xì)胞壁受到損傷，同時(shí)也伴隨著細(xì)胞的自然死亡；同時(shí)在經(jīng)歷冰浴和低溫離心之后，細(xì)胞的活性沒(méi)有完全復(fù)蘇，因此在轉(zhuǎn)化過(guò)程的初期出現(xiàn)生物量下降的現(xiàn)象；而同時(shí)，Neu5Ac卻迅速合成。在經(jīng)歷4 h的適應(yīng)期后，生物量和胞內(nèi)NeuB活性迅速上升；但在此時(shí)期內(nèi)，Neu5Ac的合成速率較低，其積累基本停滯，在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程結(jié)束后，產(chǎn)量?jī)H為（0.38±0.08）g/L。胞內(nèi)NeuB活性在4 h后顯著上升，但Neu5Ac的合成速率不升反降，且其下降的時(shí)間節(jié)點(diǎn)與生物量開(kāi)始增加的時(shí)間節(jié)點(diǎn)一致。因此推測(cè)，胞內(nèi)NeuB活性不是Neu5Ac合成的瓶頸，而在于底物或能量的供給，而此供給受到了細(xì)胞自身生長(zhǎng)的抑制。

2.2 氮源對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac的影響

氮源是大腸桿菌生長(zhǎng)不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為探究Neu5Ac合成速率下降與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的氮源種類(lèi)來(lái)控制菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，分別考察有機(jī)氮（胰蛋白胨）和無(wú)機(jī)氮（硫酸銨）為氮源時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)和Neu5Ac的合成。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的成分如表1所示。

表1 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基名稱(chēng)與成分構(gòu)成Table1 Nitrogen sources of catalysis medium

2.2.1 胰蛋白胨作為氮源對(duì)重組大腸桿菌合成Neu5Ac的影響 以Typ培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基時(shí)的轉(zhuǎn)化過(guò)程曲線見(jiàn)圖2（b）。與LB+培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基時(shí)類(lèi)似：生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的前4 h，生物量與胞內(nèi)NeuB活性迅速下降，而Neu5Ac迅速合成，將此階段命名為生物量迅速下降期。4 h后，生物量和胞內(nèi)NeuB活性停止迅速下降，轉(zhuǎn)而趨于穩(wěn)定，同時(shí)Neu5Ac依然維持較高的合成速率，至12.5 h時(shí)，Neu5Ac合成量為（0.51±0.07） g/L，將此階段命名為Neu5Ac快速合成期。12.5 h后，重組大腸桿菌構(gòu)建起了在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所需要的酶系，生物量開(kāi)始迅速上升，到生物轉(zhuǎn)化階段結(jié)束時(shí)，生物量達(dá)到（8.17±0.18）g/L，高出初始值 40%；由于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加了誘導(dǎo)劑IPTG，因此重組大腸桿菌能夠重新合成NeuB，使得胞內(nèi)NeuB活性維持在較高水平。然而，12.5 h后，Neu5Ac的合成速率沒(méi)有隨胞內(nèi)NeuB活性升高而升高，卻維持在較低水平，至生物轉(zhuǎn)化階段結(jié)束時(shí)，終質(zhì)量濃度僅為（1.01±0.06）g/L。此階段時(shí)間占總轉(zhuǎn)化合成過(guò)程的80%，而Neu5Ac合成量卻僅占總量的49.5%，將此階段命名為Neu5Ac慢速合成期。

2.2.2 硫酸銨作為氮源對(duì)重組大腸桿菌合成Neu5Ac的影響 以IS培養(yǎng)基為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基時(shí)的合成過(guò)程曲線如圖2（c）所示。生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac過(guò)程經(jīng)歷了明顯的生物量迅速下降期、Neu5Ac快速合成期和Neu5Ac慢速合成期。而進(jìn)入Neu5Ac快速合成期后，與有機(jī)氮作為氮源不同的是，生物量的下降趨勢(shì)雖有減弱但依然處于下降趨勢(shì)，在此階段的16 h內(nèi)，生物量下降了1.30 g/L，胞內(nèi)NeuB活性也同步下降。Neu5Ac以較高速率合成，在16.5 h內(nèi)積累量達(dá)（0.88±0.07）g/L。相較 Typ培養(yǎng)基，IS培養(yǎng)基中重組大腸桿菌需要更長(zhǎng)的時(shí)間構(gòu)建細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的酶系，生物量開(kāi)始回升的節(jié)點(diǎn)比Typ培養(yǎng)基中更遲，在20.5 h后，合成過(guò)程進(jìn)入Neu5Ac慢速合成期：生物量停止下降，迅速回升，到生物轉(zhuǎn)化階段結(jié)束，生物量達(dá)到（7.63±0.19）g/L，高出初始值達(dá)22.9%；而Neu5Ac的積累速度迅速下降，并維持較低的合成速率直至生物轉(zhuǎn)化過(guò)程結(jié)束，Neu5Ac的終質(zhì)量濃度為（1.20±0.04） g/L。

圖2 在不同轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中重組大腸桿菌生物轉(zhuǎn)化合成唾液酸Fig.2 Fermentation curve of Neu5Ac production in medium with different nitrogen sources for recombination E.coli

2.2.3 重組大腸桿菌在無(wú)氮培養(yǎng)基中合成Neu5Ac

Neu5Ac分子中的氨基，來(lái)源于轉(zhuǎn)化底物GlcNAc，本文所述的無(wú)氮源條件是指不添加除GlcNAc之外的氮源。無(wú)氮源條件下的Neu5Ac生物轉(zhuǎn)化合成過(guò)程也可以分成3個(gè)階段：生物量迅速下降期、Neu5Ac快速合成期和Neu5Ac慢速合成期。在3種不同氮源的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，無(wú)氮培養(yǎng)基中的Neu5Ac快速合成期持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，達(dá)到35 h，占總轉(zhuǎn)化過(guò)程時(shí)間的55.6%，分別是Typ培養(yǎng)基和IS培養(yǎng)基的8.75和2.19倍，此階段結(jié)束時(shí)，Neu5Ac質(zhì)量濃度達(dá)到為（1.79±0.11）g/L。雖然不同條件下Neu5Ac快速合成期持續(xù)的時(shí)間不一致，但此時(shí)期Neu5Ac的比合成速率基本一致（如表2所示），說(shuō)明即使在不同的轉(zhuǎn)化條件中，處于Neu5Ac快速合成期的重組大腸桿菌的生理狀態(tài)基本一致，處于有利于Neu5Ac合成的狀態(tài)。而進(jìn)入Neu5Ac慢速合成期后，重組大腸桿菌生理狀態(tài)發(fā)生的改變，成為Neu5Ac合成的關(guān)鍵限制性因素。除Neu5Ac快速合成之外，此時(shí)期的另外一個(gè)特征便是前一時(shí)期生物量迅速下降的趨勢(shì)得到緩解甚至維持相對(duì)穩(wěn)定。

在無(wú)氮培養(yǎng)基中，Neu5Ac合成速率下降拐點(diǎn)出現(xiàn)在39 h，轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)入Neu5Ac慢速合成期，生物量開(kāi)始緩慢上升，轉(zhuǎn)化過(guò)程結(jié)束時(shí)生物量?jī)H為（4.96±0.28） g/L， 比初始值（5.93±0.08 g/L）略低；Neu5Ac合成速率的下降幅度遠(yuǎn)小于氮源存在時(shí)的下降幅度，在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程結(jié)束時(shí)，Neu5Ac終質(zhì)量濃度達(dá)到（2.04±0.08）g/L。由于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中除GlcNAc外不含其他氮源，而重組大腸桿菌的GlcNAc-PTS已被敲除而無(wú)法利用GlcNAc進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)[11]，因此重組大腸桿菌只能依賴(lài)前期細(xì)胞衰亡破裂后釋放出的少量氮源進(jìn)行微弱的生長(zhǎng)。綜合LB+培養(yǎng)基、Typ培養(yǎng)和IS培養(yǎng)基中Neu5Ac合成過(guò)程曲線，可以看到，細(xì)胞的生長(zhǎng)與Neu5Ac的合成存在緊密的負(fù)相關(guān)關(guān)系：Neu5Ac合成速率下降的拐點(diǎn)與生物量上升的拐點(diǎn)吻合；細(xì)胞生長(zhǎng)越快，對(duì)Neu5Ac合成的抑制作用越早越明顯。在生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵過(guò)程中，尤其對(duì)于產(chǎn)物合成過(guò)程需要消耗大量能量時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)常與產(chǎn)物的合成互相抑制，胞內(nèi)能量供應(yīng)相對(duì)不足。李晶等[12]在土壤桿菌ATCC 31749發(fā)酵產(chǎn)熱凝膠過(guò)程中采用了氮源限制的雙階段發(fā)酵法，在菌體生長(zhǎng)階段提供充足的氮源，生物量迅速增加但產(chǎn)膠量極低；待氮源耗盡后不再流加氮源，菌體停止生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)而開(kāi)始大量合成熱凝膠。代謝流分析實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)碳限制條件轉(zhuǎn)為氮限制后，由于碳源的補(bǔ)充而使得細(xì)胞經(jīng)歷了短暫的快速生長(zhǎng)期，在此時(shí)期胞內(nèi)的pyruvate含量大幅增加，PEP相應(yīng)減少；此后由于氮源的限制，細(xì)胞停止生長(zhǎng)，胞內(nèi)的pyruvate含量減少，PEP相應(yīng)增加[13]。具體到Neu5Ac的合成過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)消耗胞內(nèi)PEP[14]，細(xì)胞的快速生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)PEP相對(duì)不足，流向Neu5Ac合成的PEP減少，抑制Neu5Ac的合成。因此，我們可以得出結(jié)論：氮源本身不是Neu5Ac合成的關(guān)鍵因素，通過(guò)限制生物轉(zhuǎn)化階段的氮源抑制細(xì)胞自身的生長(zhǎng)，減少了胞內(nèi)PEP的消耗使得更多的PEP流向Neu5Ac合成，促進(jìn)了Neu5Ac的合成。

表2 重組大腸桿菌在不同轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中合成Neu5Ac的對(duì)比Table2 Comparison of different medium for Neu5Ac production in recombination E.coli

2.3 不同類(lèi)型碳源對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac的影響

從第2.2節(jié)和第2.3節(jié)可以得出結(jié)論，胞內(nèi)PEP供給不足是Neu5Ac高效快速合成的瓶頸，增加PEP的供給對(duì)于Neu5Ac產(chǎn)量的提高有重要意義。在大腸桿菌中，通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的葡萄糖，糖酵解和糖異生途徑產(chǎn)生PEP[15]。而葡萄糖的跨膜運(yùn)輸主要依賴(lài)于磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（PTS），在跨膜的同時(shí)會(huì)消耗PEP從而磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸。這對(duì)于大腸桿菌的生長(zhǎng)具有重要意義；然而由于該過(guò)程會(huì)與Neu5Ac的合成競(jìng)爭(zhēng)胞內(nèi)的PEP，因而可能對(duì)于Neu5Ac的合成具有不利影響。因此，我們選擇不依賴(lài)于PTS系統(tǒng)的甘油為碳源，對(duì)比分析兩種碳源對(duì)重組大腸桿菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac的影響。

甘油培養(yǎng)基中生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac過(guò)程曲線如圖3所示。與上述幾種條件類(lèi)似，轉(zhuǎn)化過(guò)程可以分為3個(gè)不同階段。在生物量迅速下降期和Neu5Ac快速合成期，Neu5Ac比合成速率達(dá)到0.030 h-1，是其他條件的2～3倍。39 h后，重組大腸桿菌適應(yīng)了轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基環(huán)境后開(kāi)始生長(zhǎng)，加之胞內(nèi)NeuB活性下降，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)入Neu5Ac慢速合成期，Neu5Ac比合成速率下降（如圖4所示）。到轉(zhuǎn)化過(guò)程結(jié)束，Neu5Ac質(zhì)量濃度達(dá)到（4.42±0.08） g/L。甘油為碳源時(shí)，其跨膜運(yùn)輸不依賴(lài)于PTS，因此不消耗胞內(nèi)的PEP，從而使得更多的PEP流向Neu5Ac合成的方向，從而在生物量相同的條件下，提高了Neu5Ac的比合成速率，最終Neu5Ac合成量比無(wú)氮培養(yǎng)基中高出111.3%，比初始條件（LB+培養(yǎng)基）高出10.3倍。此外，培養(yǎng)基中甘油的存在對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性也有促進(jìn)作用，有利于底物GlcNAc進(jìn)入胞內(nèi)和產(chǎn)物Neu5Ac向胞外分泌。

圖3 甘油培養(yǎng)基對(duì)重組大腸桿菌合成唾液酸的影響Fig.3 Effects of glycerol medium on Neu5Ac production in recombination E.coli

圖4 不同轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的Neu5Ac比合成速率Fig.4 Specific production rates of Neu5Ac in different medium

目前，有多種合成Neu5Ac的方法，其中產(chǎn)量最高的方法，首先底物GlcNAc在GlcNAc異構(gòu)酶催化下生成生成ManNAc，而后ManNAc和pyruvate在Neu5Ac醛縮酶的催化下合成Neu5Ac，該方法16 h合成Neu5Ac產(chǎn)量可達(dá)74.2 g/L[16]。由于Neu5Ac醛縮酶催化的可逆反應(yīng)的反應(yīng)平衡偏向于Neu5Ac裂解成ManNAc和pyruvate，因此在上述方法中需要添加過(guò)量的pyruvate（通常至少5倍），這也導(dǎo)致了pyruvate的浪費(fèi)和額外的環(huán)境壓力。本研究中所用的方法雖然產(chǎn)量不如上述方法，但由于Neu5Ac合成酶催化合成Neu5Ac時(shí)以胞內(nèi)PEP為底物，以高能磷酸鍵為推動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行的動(dòng)力，不需要額外過(guò)量的pyruvate。該方法經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，可作為一種環(huán)境友好且高效的Neu5Ac合成方法。

3 結(jié)語(yǔ)

我們發(fā)現(xiàn)，在全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成Neu5Ac過(guò)程中，胞內(nèi)PEP的供給是Neu5Ac高效快速合成的瓶頸。當(dāng)重組大腸桿菌自身生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)消耗胞內(nèi)大量的PEP從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制Neu5Ac的合成。改用不含氮源的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，提高了Neu5Ac的合成效率。此外，通過(guò)改用不依賴(lài)PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的甘油作為碳源，避免了碳源物質(zhì)跨膜運(yùn)輸過(guò)程中PEP的消耗，大幅提高了Neu5Ac的比合成速率，終質(zhì)量濃度達(dá)到（4.42±0.08） g/L。