離子液體預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶解效率的影響

胡曉會(huì) ，程 力 *，顧正彪 ，洪 雁 ，李兆豐 ，李才明

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2．江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 食品營(yíng)養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫214122）

隨著化石能源的日益短缺及環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，發(fā)展和利用產(chǎn)量巨大、來(lái)源豐富的綠色可再生資源木質(zhì)纖維素意義重大。木質(zhì)纖維素作為地球上最豐富的可再生資源之一[1-2]，主要來(lái)源于木材及農(nóng)作物秸稈，含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3個(gè)主要組分[3]。纖維素是由D-葡萄糖通過(guò)1，4糖苷鍵連接而成的多糖，纖維素中含有大量氫鍵，難溶于一般有機(jī)溶劑[4]；半纖維素是由不同種糖單元組成的復(fù)合聚糖[5]；木質(zhì)素作為細(xì)胞壁的主要成分之一，是由苯基丙烷單元通過(guò)醚鍵、碳-碳鍵連接而成的復(fù)雜、無(wú)定型的高聚物[6]。木質(zhì)素和半纖維素通過(guò)共價(jià)鍵形成緊密鏈接并包裹著纖維素，木質(zhì)素的存在不僅不可逆地吸附纖維素酶，還阻止酶與底物接觸[7]。對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行高效酶解并以此為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化為燃料乙醇和各類化工產(chǎn)品，需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理以打破木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)，除去木質(zhì)素等抑制組分，并降低纖維素的結(jié)晶度。

傳統(tǒng)的預(yù)處理方法包括物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法，但多數(shù)存在環(huán)境污染大，生產(chǎn)效率低等缺點(diǎn)[8-11]。離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子構(gòu)成的在室溫或接近室溫下熔融的鹽。作為新型綠色溶劑，離子液體對(duì)木質(zhì)纖維素組分有良好溶解性能，且具有不揮發(fā)、環(huán)境污染小、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。纖維素溶于離子液體后，通過(guò)加入反溶劑可以使纖維素再生出來(lái)，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、洗滌和干燥就能得到非晶態(tài)的、更易被酶解的再生纖維素。另外，通過(guò)改變生成再生纖維素的過(guò)程與條件，可制成不同結(jié)構(gòu)與形狀的纖維素材料，如粉末狀、珠狀、纖維狀及片狀等。研究表明，離子液體對(duì)木質(zhì)纖維素各組分的溶解效果與離子液體的種類有關(guān)。體積小、極性強(qiáng)的氯離子對(duì)纖維素有較好的溶解性，而[BF]、[PF]、[NTf]等陰離子對(duì)纖維素的溶解性較差[14]。

目前關(guān)于離子液體預(yù)處理木質(zhì)纖維素的研究較少，對(duì)纖維素或木質(zhì)素有較好溶解性的離子液體預(yù)處理木質(zhì)纖維素后底物的酶解效率不一定高[15-16]。為了研究不同類型的離子液體對(duì)木質(zhì)纖維素各組分溶解效果的差異及預(yù)處理后底物物料成分、結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的改變，及這些改變與酶解效率之間的關(guān)系，本論文選用4種不同類型的離子液體：1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[Emim]Ac）、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[Amim]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽（[Bmim]HSO4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[Bmim]BF4）對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理，比較并分析了木質(zhì)纖維素成分、形貌和結(jié)構(gòu)的改變對(duì)酶解效率的影響，總結(jié)出影響木質(zhì)纖維素酶解效率的主要因素，以期對(duì)木質(zhì)纖維素相關(guān)預(yù)處理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

玉米秸稈，由長(zhǎng)春大成玉米開(kāi)發(fā)有限公司提供，4種離子液體1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[Emim]Ac）、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[Amim]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽（[Bmim]HSO4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[Bmim]BF4），均購(gòu)自上海成捷化學(xué)有限公司；纖維素酶（ATCC 26921，45 FPU/mL）、堿木質(zhì)素、微晶纖維素和木聚糖，均購(gòu)自Sigma公司；濃硫酸、碳酸鈣、檸檬酸、檸檬酸鈉、3，5-二硝基水楊酸等，均為分析純?cè)噭?，?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素在離子液體中的溶解度測(cè)定 溶解度測(cè)定方法參照LEE等[17]的方法稍加改動(dòng)。[Bmim]BF4對(duì)木質(zhì)素溶解能力較差，取50 mg木質(zhì)素加入1 g[Bmim]BF4中，90℃下磁力攪拌12 h，10000 r/min離心1 min，取0.1 g懸浮液加入0.9 mL 0.1 moL/L NaOH溶液，以木質(zhì)素為標(biāo)準(zhǔn)品用分光光度計(jì)在280 nm處測(cè)定木質(zhì)素含量；[Amim]Cl、[Bmim]HSO4、[Emim]Ac 對(duì)木質(zhì)素的溶解能力較好，因此，分別取0.5 g木質(zhì)素加入5 g離子液體中，90℃下磁力攪拌，若完全溶解，再加0.5 g木質(zhì)素，12 h內(nèi)累計(jì)木質(zhì)素添加量為其溶解度。

4種離子液體的纖維素和半纖維素的溶解度測(cè)定方法：取0.5 g微晶纖維素或木聚糖，加至5 g離子液體中90℃下磁力攪拌，若完全溶解，再加0.5 g微晶纖維素或木聚糖，12 h內(nèi)累計(jì)微晶纖維素或木聚糖添加量為其纖維素或半纖維素溶解度。

1.2.2 玉米秸稈離子液體預(yù)處理 將風(fēng)干后的物料粉碎并篩選40～60目顆粒備用。取2.5 g物料和50 g離子液體置于250 mL耐壓瓶中，130℃烘箱中放置1.5 h，取出，冷卻至室溫后，向體系中緩慢加入100 mL去離子水，離心、沉淀洗滌至上清液無(wú)色，置于50℃烘箱中烘干備用[15]。所有試驗(yàn)平行3組。

式（1）中，A為回收率；A0為原樣品質(zhì)量；A1為預(yù)處理后樣品質(zhì)量。

1.2.3 離子液體預(yù)處理前后纖維素酶酶解 分別取1 g預(yù)處理前后的樣品，加入適量的纖維素酶（25 FPU/g）和pH值為4.8的0.05 moL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，50℃、100 r/min條件下進(jìn)行酶解糖化反應(yīng)，定時(shí)取樣，沸水滅活，過(guò)0.45 μm水系膜，采用高效液相法（HPLC）測(cè)定水解液中葡萄糖含量。

式（2）中，B為酶解效率；B1為酶解產(chǎn)生的葡萄糖量；B1為材料所含纖維素量。

1.3 分析方法

1.3.1 成分分析 玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的分析參照美國(guó)能源部可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）的方法進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.3.2 掃描電子顯微鏡（SEM）分析 玉米秸稈固定在樣品臺(tái)上，離子濺射儀濺射噴金，然后在日立 S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立株式會(huì)社）下觀察纖維素的形態(tài)。

1.3.3 X-ray衍射分析 預(yù)處理前后玉米秸稈的X-衍射結(jié)晶度通過(guò)D8 Advance型X-衍射分析儀（德國(guó) Bruker AXS公司）測(cè)得。掃描范圍 10°～40°，掃描速度2°/min，掃描電壓與電流分別為40 kV、40 mA。

1.3.4 熱重分析 采用梅特勒-托利多儀器有限公司TGA/SDTA851e熱重分析儀來(lái)測(cè)定預(yù)處理前后秸稈樣品的熱穩(wěn)定性，分別將5 mg左右預(yù)處理前后的秸稈材料置于坩堝容器內(nèi)，在N2保護(hù)下，以15℃/min的加熱速率從25℃升溫至500℃，記錄樣品質(zhì)量隨溫度變化的關(guān)系曲線。

1.3.5 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析 取預(yù)處理前后的樣品以1∶100比例同溴化鉀混勻后，研磨至約300目粉末，壓片，利用Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Scientific公司），掃描波長(zhǎng)范圍是 4000～400 cm-1，分辨率是 2 cm-1，掃描32次，空氣為背景。

2 結(jié)果與討論

2.1 秸稈主要組分在離子液體中的溶解度

要選擇出處理效果較好的離子液體，需要考慮3方面因素：1）離子液體對(duì)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的溶解度；2）離子液體從原料中選擇性提取木質(zhì)素的能力；3）預(yù)處理后物料的酶解效率[19]。木質(zhì)素與半纖維素通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包裹著纖維素，因此，需要離子液體對(duì)各組分有一定的溶解度并能打破木質(zhì)素與半纖維素之間的共價(jià)鍵才能有效地將木質(zhì)素提取出來(lái)增加纖維素酶與底物的可及性從而提高酶解效率[20]。由表1可知，[Emim]Ac和 [Amim]Cl對(duì)木質(zhì)纖維素各組分都有較好的溶解效果，[Bmim]HSO4對(duì)木質(zhì)素和半纖維素有較好的選擇性溶解效果，而[Bmim]BF4對(duì)木質(zhì)纖維素各組分都基本不溶。

2.2 離子液體預(yù)處理前后秸稈的成分分析和酶解效率

結(jié)合表1和表2可以看出，木質(zhì)素的去除可以有效地提高物料的酶解效率。[Emim]Ac和[Amim]Cl對(duì)木質(zhì)纖維素各組分都有較高的溶解度，其木質(zhì)素去除效果也較好，預(yù)處理后物料的酶解效率也較高。另外，[Emim]Ac具有較好的選擇性去除木質(zhì)素的效果，即在預(yù)處理過(guò)程中保留了可以被酶解的纖維素和半纖維素，除去了阻礙底物酶解的木質(zhì)素，保證底物的物料得率，節(jié)約資源降低成本。

[Bmim]HSO4對(duì)木質(zhì)素和半纖維素溶解效果較好，但其木質(zhì)素去除效果并不理想，其酶解效率也較低。[Bmim]BF4對(duì)木質(zhì)纖維素的各個(gè)組分溶解效果并不理想，但預(yù)處理后去除木質(zhì)素的能力大于[Bmim]HSO4，酶解效率與[Amim]Cl預(yù)處理后物料的酶解效率相當(dāng)。為了進(jìn)一步研究預(yù)處理對(duì)物料酶解效率的影響因素，對(duì)預(yù)處前后物料的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

表1 堿木質(zhì)素、微晶纖維素和木聚糖在離子液體中的溶解度Table1 Solubility of lignocellulose constituents in ionic liquid

表2 離子液體預(yù)處理前后秸稈成分分析和酶解效率（±s）Table2 Constituents of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquid（±s）%

表2 離子液體預(yù)處理前后秸稈成分分析和酶解效率（±s）Table2 Constituents of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquid（±s）%

注：酶解條件：1 g樣品，25 FPU/g纖維素酶，50 mmoL/L緩沖液（pH 4.8），酶解體系為 100 mL，50℃，100 r/min，酶解時(shí)間為 12 h；同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理之間在0.05水平存在顯著差異

離子液體回收率纖維素15.79±0.45 d半纖維素木質(zhì)素10 0.00±0.00 a 原材料15.77±0.45 b 30.89±0.30 a 24.27±0.35 a 76.61±0.56 c [E m i m]A c 28.01±0.30 b 11.02±0.45 d 91.20±0.25 a[A m i m]C l 18.47±0.50 d 68.42±0.43 d 16.60±0.43 a 13.75±0.38 c 28.37±0.34 c[B m i m]H S O 4[B m i m]B F 4 75.30±0.55 c 25.37±0.51 c 10.29±0.42 e 10.11±0.21 e 16.25±0.19 b 12.41±0.53 e 79.24±0.29 b 28.91±0.89 b 11.58±0.28 d酶解效率12.93±0.28 c 29.49±0.25 b

2.3 離子液體預(yù)處理前后玉米秸稈物理化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）分析 從圖1可看出，未經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)平滑致密，與纖維素酶接觸位點(diǎn)有限，酶解效果比較差，預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素表面發(fā)生較大變化，致密平滑的結(jié)構(gòu)被破壞，變得疏松多孔，這可能是由于除去了木質(zhì)素、半纖維素和無(wú)定型纖維素導(dǎo)致的，疏松的結(jié)構(gòu)為纖維素酶提供較多的接觸位點(diǎn)，木質(zhì)素的去除減少了纖維素酶的無(wú)效吸附，因此預(yù)處理后木質(zhì)纖維素的酶解效率較原材料高。其中，相比于其他3種離子液體，[Emim]Ac預(yù)處理后物料最為疏松多孔，纖維素酶更易進(jìn)入物料內(nèi)部與底物接觸，預(yù)處理后物料的酶解效率較其他3種離子液體高。

圖1 離子液體預(yù)處理前后秸稈電鏡圖（×1200）Fig．1 SEM imagines of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquids（×1200）

2.3.2 X-ray衍射分析 由圖2可以看出，預(yù)處理前2θ=15.26°、22.54°的峰為纖維素晶型 I的出峰位置，[Emim]Ac預(yù)處理后2θ=15.26°處的峰消失，在 2θ=22.1°處有峰，說(shuō)明預(yù)處理后纖維素發(fā)生了晶型的轉(zhuǎn)變，由晶型I轉(zhuǎn)變?yōu)楦妆幻附獾木虸I[21]，因此[Emim]Ac預(yù)處理過(guò)后的秸稈由于結(jié)晶型纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)楦妆幻附獾臒o(wú)定型纖維素從而酶解效率提高至91.20%，SAMAYAMIP等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明了晶型的轉(zhuǎn)變有利于酶解。相對(duì)于[Emim]Ac的預(yù)處理效果，其他3種離子液體在130℃、1.5 h處理?xiàng)l件下并沒(méi)有改變纖維素的晶型，且2θ=22.54°處的峰較原材料更尖銳，許多研究者在木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，這是由于預(yù)處理除去了原材料中無(wú)定型纖維素而導(dǎo)致其相對(duì)結(jié)晶度增大。

2.3.3 熱重分析 生物質(zhì)中不同組分的熱穩(wěn)定性差異很大，其中，纖維素和木質(zhì)素含量是生物質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要影響因素[23]。不同離子液體預(yù)處理后秸稈的熱穩(wěn)定性如圖3所示。從圖3中可以看出，預(yù)處理前后秸稈的主要降解溫度為200～400℃，未經(jīng)處理的秸稈在348℃時(shí)質(zhì)量百分比降至50%，而[Emim]Ac、[Amim]Cl、[Bmim]HSO4預(yù)處理過(guò)后的秸稈分別在270、329、330℃降至初始質(zhì)量的50%，這是由于預(yù)處理過(guò)程中離子液體進(jìn)入到物料內(nèi)部導(dǎo)致秸稈疏松多孔，因此預(yù)處理后物料熱穩(wěn)定性有所下降。其中，[Emim]Ac預(yù)處理后的秸稈熱穩(wěn)定性最差，是由于[Emim]Ac預(yù)處理過(guò)程中纖維素由結(jié)晶纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定性纖維素從而導(dǎo)致樣品易被熱降解。[Bmim]BF4處理后的樣品則在352℃質(zhì)量百分比降至50%，與預(yù)處理前物料相當(dāng)，是由于[Bmim]BF4對(duì)木質(zhì)纖維素各個(gè)組分溶解能力較差而無(wú)法滲透至物料內(nèi)部形成疏松多孔結(jié)構(gòu)。

圖2 離子液體預(yù)處理前后秸稈的XRD譜圖Fig．2 XRD imagines of corn stalk before and after pretreatment by ionic liquids

圖3 離子液體預(yù)處理前后秸稈熱重分析曲線Fig．3 Thermogravimetric analysis of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquids

當(dāng)溫度加熱至500℃時(shí)，預(yù)處理前后的秸稈均有少量殘余物，是在N2環(huán)境中產(chǎn)生的富碳化合物[24]，但可以明顯的看到預(yù)處理后樣品殘余物量低于原材料，是由于離子液體預(yù)處理去除了部分木質(zhì)素和灰分，因此殘余物量較少[25]。

2.3.4 FT-IR分析 由預(yù)處理前后物料的FT-IR圖4可以看出，預(yù)處理后木質(zhì)素芳環(huán)骨架的特征吸收峰1512 cm-1明顯減弱，這表明在預(yù)處理過(guò)程中木質(zhì)素被脫除或被破壞[26]。[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac預(yù)處理后半纖維素中的羰基C=O伸縮振動(dòng)1732 cm-1基本消失，木質(zhì)素和半纖維素之間CO伸縮振動(dòng)信號(hào)峰1249 cm-1強(qiáng)度減弱，說(shuō)明預(yù)處理打破了半纖維素和木質(zhì)素之間的連接酯鍵[27]，而[Bmim]HSO4預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素在1732 cm-1處的信號(hào)峰只是有所減弱并沒(méi)有消失，說(shuō)明[Bmim]HSO4預(yù)處理破壞半纖維素和木質(zhì)素鏈接酯鍵的能力不如[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac，而破壞半纖維素和木質(zhì)素的能力與預(yù)處理后物料的酶解效呈正相關(guān)，此結(jié)果與表2中酶解效果一致，這與DEMARTINI等[28]在研究細(xì)胞壁乙醇發(fā)酵過(guò)程中得出的結(jié)論一致。

圖4 離子液體預(yù)處理前后秸稈的FT-IR譜圖Fig．4 FT-IR imagines of corn stalks before and after pretreatment by different ionic liquids

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac預(yù)處理都可提高秸稈的酶解效率。其中，[Emim]Ac預(yù)處理可以選擇性地去除木質(zhì)素，減少纖維素酶的無(wú)效吸附；打破木質(zhì)素和半纖維素之間的共價(jià)鍵，破壞包裹著纖維素的緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使纖維素暴露；處理后秸稈中結(jié)晶纖維素轉(zhuǎn)化為更易被酶解的無(wú)定型纖維素，大幅度提高了纖維素的酶解效率。這些預(yù)處理后理化性質(zhì)的改變有效地提高了玉米秸稈的酶解效率，相比于原材料提高了4.77倍。