基于擬比對(duì)CNN方法的人類p53癌癥基因二級(jí)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建及分析

王丹丹，李晨鴻，徐海陽，蔡 蓉，朱 平

（江南大學(xué) 理學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

隨著各種模式生物基因組計(jì)劃的相繼完成或全面實(shí)施，有關(guān)核酸、蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)等生物學(xué)數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長(zhǎng)，越來越多基因的結(jié)構(gòu)和功能得到闡明，建立簡(jiǎn)潔、專用性強(qiáng)和數(shù)據(jù)質(zhì)量高的二級(jí)數(shù)據(jù)庫及分析系統(tǒng)已成為研究熱點(diǎn)之一[1-2]。

各類二級(jí)數(shù)據(jù)庫的建立是研究生物信息學(xué)的重要出發(fā)點(diǎn)。一般而言，生物信息一級(jí)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)來源于原始實(shí)驗(yàn)室的直接提交，而對(duì)一級(jí)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行搜索、加工和整理成二級(jí)數(shù)據(jù)庫，已廣泛應(yīng)用于生物信息學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域[3-5]。目前被公認(rèn)是癌癥生物標(biāo)志物的p53抑癌基因最初被認(rèn)為是一種癌基因，隨著近十年研究的深入，p53作為抑癌基因的功能逐漸被揭示，對(duì)p53基因的研究也日益受到重視[6-7]。其中汪小霞等[8]揭示了EZH2與p53表達(dá)的正相關(guān)性以及EZH2蛋白在腫瘤中受p53基因調(diào)控的現(xiàn)象；MAKWANE等[9]通過聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)人類乳腺癌p53腫瘤抑制基因的外顯子5和7存在突變。p53基因突變與人類腫瘤的關(guān)系十分密切，已成為腫瘤發(fā)病的主要因素，而隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，很多癌癥可以進(jìn)行基因治療，因此，有必要建立一個(gè)關(guān)于p53基因的二級(jí)生物信息數(shù)據(jù)庫對(duì)p53基因進(jìn)行深入分析研究。

在生物信息學(xué)中，基因序列比對(duì)已成為一種處理基因信息的基本方法，有利于發(fā)現(xiàn)生物序列的功能、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化信息。目前，序列比對(duì)算法主要包括Smith-Waterman算法、BLAST算法和FASTA算法等[10-11]。Smith-Waterman算法敏感性強(qiáng)，但復(fù)雜度很高，運(yùn)算速度較慢，后2種序列比對(duì)算法具有更高的運(yùn)算速度，但敏感性較差。而一維細(xì)胞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（cellular neural network，CNN）[12-13]序列比對(duì)算法是一種新提出的序列比對(duì)算法，具有較低時(shí)間復(fù)雜度和良好的敏感性。本研究采用擬比對(duì)一維CNN序列比對(duì)算法應(yīng)用于不同癌癥p53基因序列比對(duì)，并改善算法相似度評(píng)估公式，大大增強(qiáng)了序列比對(duì)結(jié)果的敏感性和可靠性。

本研究中主要針對(duì)p53癌癥基因的外顯子和內(nèi)含子數(shù)據(jù)，構(gòu)建一個(gè)二級(jí)生物信息數(shù)據(jù)庫。通過NCBI（National Center for Biotechnology Information）一級(jí)數(shù)據(jù)庫收集p53癌癥基因序列，經(jīng)過解析與歸納將二級(jí)數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)為包含p53信息、癌癥信息、樣本信息和參考文獻(xiàn)信息等4個(gè)部分，實(shí)現(xiàn)二級(jí)數(shù)據(jù)庫的信息查尋與使用，并通過Agent程序?qū)崿F(xiàn)數(shù)據(jù)庫的自動(dòng)更新和維護(hù)。采用改進(jìn)相似度評(píng)估公式的CNN序列比對(duì)算法，增強(qiáng)了序列比對(duì)敏感性，使乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌p53外顯子基因序列比對(duì)結(jié)果更可靠。

1p53癌癥基因二級(jí)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

1.1 數(shù)據(jù)源

NCBI是國際主要生命科學(xué)信息服務(wù)機(jī)構(gòu)之一，每天都有大量來自實(shí)驗(yàn)室和測(cè)序機(jī)構(gòu)發(fā)布的序列數(shù)據(jù)進(jìn)入該數(shù)據(jù)庫，并保持與其他數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)交換和更新，因而匯集了當(dāng)前所有公開的核酸和蛋白質(zhì)序列，本二級(jí)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)主要來源于NCBI維護(hù)的基因數(shù)據(jù)庫。

本研究中采用 p53、human、cancer、exon、intron等關(guān)鍵詞搜索一級(jí)數(shù)據(jù)庫，通過代理程序自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)庫Web信息資源，并對(duì)其進(jìn)行檢索、歸納和轉(zhuǎn)換產(chǎn)生二級(jí)數(shù)據(jù)庫，其流程圖如圖1所示。

本二級(jí)數(shù)據(jù)庫目前已經(jīng)收集了包括乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌等16種癌癥的516條p53癌癥基因序列。

圖1 下載一級(jí)數(shù)據(jù)庫流程Fig.1 Download the flow chart of primary database

1.2 數(shù)據(jù)解析

本研究所構(gòu)建的二級(jí)數(shù)據(jù)庫主要過程見圖2。首先從NCBI一級(jí)數(shù)據(jù)庫中下載p53癌癥基因，并保存為網(wǎng)頁信息，然后使用XML Document類DOM模型創(chuàng)建、修改、遍歷XML文檔，運(yùn)行后臺(tái)解析程序?qū)ML文檔進(jìn)行映射，實(shí)現(xiàn)批量導(dǎo)入數(shù)據(jù)。最后，采用XML技術(shù)將各種異構(gòu)數(shù)據(jù)源數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成XML公共數(shù)據(jù)模型格式，實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)資源和二級(jí)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)交換，同時(shí)以GBseq XML格式獲取文本數(shù)據(jù)并構(gòu)建本地二級(jí)數(shù)據(jù)庫。

圖2 構(gòu)建二級(jí)數(shù)據(jù)庫的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig.2 System architecture of the construction of secondary database

1.3 數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

1.3.1 數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu) 本研究所構(gòu)建的二級(jí)數(shù)據(jù)庫主頁包含了1個(gè)集合，這個(gè)集合包含各種癌癥子集合，每個(gè)子集合包含癌癥p53基因序列的外顯子或內(nèi)含子信息。同時(shí)以圖片形式展示人體各部分癌癥位點(diǎn)，用戶可以點(diǎn)擊圖片進(jìn)行瀏覽，也可通過關(guān)鍵字搜索查找p53基因序列編號(hào)，如果數(shù)據(jù)庫中有這一條序列則會(huì)自動(dòng)跳轉(zhuǎn)到對(duì)應(yīng)序列，如未能找到相應(yīng)p53序列編號(hào)，則不顯示任何信息。

當(dāng)用戶點(diǎn)擊某種癌癥圖片進(jìn)入對(duì)應(yīng)頁面，可以看到包括p53信息、癌癥信息、樣本信息、參考文獻(xiàn)信息等實(shí)體信息。用戶如對(duì)某個(gè)癌癥p53基因序列的詳細(xì)信息感興趣，可以點(diǎn)擊more按鍵詳細(xì)查看NCBI一級(jí)數(shù)據(jù)庫中這條序列的完整信息，同時(shí)也可鏈接到p53研究的原始文獻(xiàn)進(jìn)一步閱讀，查看包括癌癥名稱、p53外顯子或內(nèi)含子、樣本信息（樣本數(shù)、樣本來源）以及參考文獻(xiàn)信息（題目、發(fā)表年、PMID）等具體信息。

本二級(jí)數(shù)據(jù)庫的實(shí)體信息主要包括以下4個(gè)部分：（1）p53信息，主要包含p53基因序列在數(shù)據(jù)庫中編號(hào)（Accession）、p53某個(gè)外顯子或者內(nèi)含子基因序列以及外顯子對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列、每條序列的長(zhǎng)度和起始子位置；（2）癌癥信息，主要包含癌癥的名稱、癌癥的分類；（3）樣本信息，主要包含樣本來源、樣本數(shù)、樣本類型、樣本的研究方法；（4）參考文獻(xiàn)信息，主要包含文獻(xiàn)題目、PMID、發(fā)表日期、備注等。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫功能模塊 本數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)分為5個(gè)模塊：第1個(gè)模塊為癌癥p53基因外顯子或內(nèi)含子序列顯示系統(tǒng)，包含了各種癌癥及癌癥部位顯示圖，用戶可以通過點(diǎn)擊癌癥圖片的方式，了解具體癌癥p53基因序列信息。

第2個(gè)模塊為數(shù)據(jù)庫介紹模塊，介紹了數(shù)據(jù)庫的基本內(nèi)容，包括數(shù)據(jù)庫更新信息、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息、數(shù)據(jù)內(nèi)容介紹。

第3個(gè)模塊為搜索系統(tǒng)，用戶可以通過輸入癌癥p53序列編號(hào)，了解該p53序列是否被測(cè)序出來，是否在數(shù)據(jù)庫中，如果有，則數(shù)據(jù)庫會(huì)給出相應(yīng)的序列信息，用戶可通過點(diǎn)擊的方式了解詳細(xì)信息。

第4個(gè)模塊為用戶數(shù)據(jù)提交系統(tǒng)，作為一個(gè)大的整合型的數(shù)據(jù)庫，我們盡可能收集所有數(shù)據(jù)，如果用戶有新數(shù)據(jù)可以提交至我們的數(shù)據(jù)庫，將由后臺(tái)人員進(jìn)行數(shù)據(jù)審查。

第5個(gè)模塊為數(shù)據(jù)共享，即作為一個(gè)公開的數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)是共享的，數(shù)據(jù)庫中的信息是以Excel表形式進(jìn)行匯總，全面涵蓋了所存儲(chǔ)數(shù)據(jù)，用戶可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行下載使用。

1.4 二級(jí)數(shù)據(jù)庫的管理與更新

二級(jí)數(shù)據(jù)庫的管理系統(tǒng)能夠有效減輕管理員的負(fù)擔(dān)，目前已經(jīng)有多種不同環(huán)境下的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)。二級(jí)數(shù)據(jù)庫管理主要步驟包括增刪相應(yīng)序列和編輯二級(jí)數(shù)據(jù)庫注釋信息、二級(jí)數(shù)據(jù)庫更新需與一級(jí)數(shù)據(jù)庫更新同步，主要包括修改序列條目、刪除冗余條目和加入新條目。

隨著一級(jí)數(shù)據(jù)庫中已有數(shù)據(jù)的不斷變更以及新數(shù)據(jù)的不斷加入，人工更新方式已難以滿足二級(jí)數(shù)據(jù)庫的實(shí)時(shí)有效更新，因此，需要采用一種自動(dòng)獲取Web信息的方法實(shí)現(xiàn)二級(jí)數(shù)據(jù)庫自動(dòng)更新。而SQL Server提供的企業(yè)級(jí)管理軟件能夠進(jìn)行常規(guī)任務(wù)的自動(dòng)化管理，管理員可以通過SQL Server提供的Agent服務(wù)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫的自動(dòng)管理和更新。利用Agent服務(wù)在特定日期及時(shí)檢測(cè)一級(jí)數(shù)據(jù)庫中的版本信息，二級(jí)數(shù)據(jù)庫通過接收Agent服務(wù)消息并與二級(jí)數(shù)據(jù)庫對(duì)應(yīng)的版本號(hào)進(jìn)行比較，主動(dòng)對(duì)二級(jí)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行更新，若版本號(hào)變動(dòng)則自動(dòng)下載更新該條目，通過匹配一級(jí)數(shù)據(jù)庫中有關(guān)p53基因信息條目的版本號(hào)，自動(dòng)判斷該條目是否已在二級(jí)數(shù)據(jù)庫中存在，不存在則通過文本消息通知管理員添加該條目[3，14]。與人工更新方式相比，SQL Server Agent服務(wù)能夠高效地完成數(shù)據(jù)庫自動(dòng)管理和更新。

2 擬比對(duì)CNN序列比對(duì)方法

一維CNN模型具有一個(gè)線性細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)，每個(gè)細(xì)胞最多有兩個(gè)相連細(xì)胞，這些特點(diǎn)可以有效地來進(jìn)行兩條DNA序列比對(duì)。一維CNN與傳統(tǒng)CNN不同，因?yàn)樗鼉H由兩個(gè)單獨(dú)的一維細(xì)胞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組成，一個(gè)固定的主子網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)可移動(dòng)的從子網(wǎng)絡(luò)，分別代表兩條DNA序列片段，其中網(wǎng)絡(luò)中每一個(gè)細(xì)胞都對(duì)應(yīng)DNA序列中的堿基。算法中從子網(wǎng)絡(luò)隨時(shí)間以固定距離移動(dòng)，計(jì)算主子網(wǎng)絡(luò)中每一個(gè)細(xì)胞在不同時(shí)刻的狀態(tài)值，最終將所得到的狀態(tài)值進(jìn)行排列形成狀態(tài)矩陣，通過動(dòng)態(tài)規(guī)劃方法產(chǎn)生一條全局比對(duì)最優(yōu)路徑。在這條路徑的引導(dǎo)下，通過在合適的位置插空使得兩條長(zhǎng)度不同的DNA序列變成長(zhǎng)度相同新的DNA序列，然后對(duì)這兩條DNA序列片段進(jìn)行全局比對(duì)。

一維CNN計(jì)算公式如下：

其中，x1，i(t)表示主子網(wǎng)絡(luò)中細(xì)胞i在t時(shí)刻的狀態(tài)，y1，i(t)表示從細(xì)胞i中接收到的反饋輸出，Ak，Bk分別是反饋模板A和控制模板B的系數(shù)，Ii，Rx和C是3個(gè)常量，y1，k(t)和u1，i(t)分別為細(xì)胞k在t時(shí)刻的輸出和相關(guān)輸入。

具體序列比對(duì)步驟如下：

Step1：設(shè)置CNN初始值，將DNA序列化為可計(jì)算的數(shù)字特征，最基本的特征{*，A，C，G，T}相應(yīng)的量化為{0，-1，-0.5，0.5，1}，“*”代表空格。

Step2：通過狀態(tài)選擇函數(shù)計(jì)算狀態(tài)矩陣，其中狀態(tài)選擇函數(shù)計(jì)算公式為：

Step3：根據(jù)狀態(tài)矩陣形成全局比對(duì)的路徑。通過最后的狀態(tài)逐步回溯到第1個(gè)狀態(tài)，其中每個(gè)狀態(tài)選取規(guī)則為包含上1個(gè)狀態(tài)左上角2×2矩陣中的最大值。例如，狀態(tài)矩陣中的m行n列的狀態(tài)為(n，m)則其下 1 個(gè)狀態(tài)選取規(guī)則為在（n，m-1）、（n-1，m-1）、（n-1，m）中選取最大值，然后將其作為下 1個(gè)狀態(tài)值。

Step4：根據(jù)所選路徑對(duì)2條DNA序列進(jìn)行全局比對(duì)，如果前后2個(gè)狀態(tài)橫坐標(biāo)相差1，縱坐標(biāo)相差0，則在第一條序列中插入1個(gè)空格，如果前后2個(gè)狀態(tài)橫坐標(biāo)相差0，縱坐標(biāo)相差1，則在第2條序列中插入1個(gè)空格，其他情況則序列保持不變。

Step5：計(jì)算2條序列比對(duì)的相似度評(píng)估。將CNN序列比對(duì)方法中的計(jì)算相似度公式改進(jìn)為：

其中Nma為步驟4中2條序列匹配的個(gè)數(shù)，L(S1)、L(S2)分別為序列S1、S2的長(zhǎng)度。假設(shè)兩序列S1、S2中S1長(zhǎng)度較短，可知Nma∈{0，1，……，L(S1)}，則由式（5）可以得出當(dāng)兩序列匹配個(gè)數(shù)為零時(shí)，其最小相似度為零；當(dāng)兩序列匹配個(gè)數(shù)達(dá)到最大，即較短序列的長(zhǎng)度時(shí)，其相似度最大，該最大相似度與兩序列長(zhǎng)度相關(guān)，當(dāng)兩序列長(zhǎng)度相同時(shí)，最大相似度為1，當(dāng)兩序列長(zhǎng)度相差較大時(shí)，最大相似度趨近于0.5。因此，改進(jìn)后的相似度評(píng)估公式增強(qiáng)了序列比對(duì)敏感性，使得序列比對(duì)結(jié)果更可靠。

其中將公式（1）中的初始值取為C=1，Rx=1，I=0，A={0，0，0}，B={0，1，-1}，F(xiàn)={F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3}={5，4，2}。

定義1：稱如上定義的CNN方法為擬比對(duì)CNN方法。

3 基于擬比對(duì)CNN的p53癌癥基因序列比對(duì)

為了探討不同癌癥p53基因之間的區(qū)別和聯(lián)系，本研究以乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌為例進(jìn)行序列比對(duì)，分析這兩種癌癥之間的聯(lián)系與區(qū)別。分別對(duì)乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌p53基因的Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8和 Exon9進(jìn)行擬比對(duì) CNN 算法比對(duì)，其中乳腺癌的Exon4有15條，Exon5有28條，Exon6有27條，Exon7有38條，Exon8有39條，Exon9有50條；非小細(xì)胞肺癌的Exon4有13條，Exon5有 25條，Exon6有 20條，Exon7有 35條，Exon8有37條，Exon9有48條。

分別采用CNN方法、BLAST序列比對(duì)方法和擬比對(duì)CNN方法對(duì)2種癌癥p53基因同一外顯子序列進(jìn)行比對(duì)，表1中擬比對(duì)CNN方法利用步驟5所給出的兩序列相似度評(píng)估公式（5）對(duì)Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9 的 DNA 序列進(jìn)行全局比對(duì)，其中Mean為平均值，Std為標(biāo)準(zhǔn)差。

從表1中可以看出，擬比對(duì)CNN方法相比CNN方法和BLAST序列比對(duì)方法有較高的全局相似度，尤其當(dāng)序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)時(shí)擬比對(duì)CNN相比CNN和BLAST全局相似度提高較多。此外，采用擬比對(duì)CNN方法對(duì)兩種癌癥p53基因的外顯子序列比對(duì)相似度的標(biāo)準(zhǔn)差相對(duì)較小。表明擬比對(duì)CNN方法相比于其他兩種方法不僅具有較好的敏感性，而且其結(jié)果的可靠性良好。

從表1還可以看出，采用擬比對(duì)CNN方法對(duì)乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的p53基因外顯子進(jìn)行比對(duì)，其結(jié)果有很大不同。其中Exon5相比于Exon4、Exon6、Exon7、Exon8 和 Exon9 而言相似度最低，只有55.34%，而Exon4的相似度最高，達(dá)到了99.75%，其他幾個(gè)外顯子也都超過了95%，這表明乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌p53的Exon5序列突變存在較大差異。因此，在突變的p53外顯子中Exon5可以作為區(qū)別乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌參考標(biāo)準(zhǔn)，而其他幾個(gè)p53癌癥基因外顯子難以作為區(qū)別乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的參考標(biāo)準(zhǔn)。

表1 擬比對(duì)CNN、CNN與BLAST方法的全局相似度比較Table1 Global similarity comparisons between quasi alignment CNN、CNN and BLAST algorithms

將擬比對(duì)CNN方法與CNN方法和BLAST序列比對(duì)方法對(duì)乳腺癌和肺癌的 Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9 序列比對(duì)時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。

由于擬比對(duì)CNN方法對(duì)2條p53基因序列進(jìn)行比對(duì)，其時(shí)間復(fù)雜度為O（T）=O（m，n）≈O（m+n+1），而BLAST比對(duì)算法的時(shí)間復(fù)雜度為O（T）=O（m×n）較高，其中m、n分別為2條序列的長(zhǎng)度，所以擬比對(duì)CNN方法有效降低了算法的時(shí)間復(fù)雜度。

從表2可以看出，就計(jì)算時(shí)間而言不論是較長(zhǎng)的序列還是較短的序列擬比對(duì)CNN方法和CNN方法都比BLAST所需要的計(jì)算時(shí)間短很多，且就擬比對(duì)CNN方法本身而言序列總長(zhǎng)度越長(zhǎng)比對(duì)所需計(jì)算時(shí)間也越長(zhǎng)。因此，采用擬比對(duì)CNN方法對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)有效提高了算法運(yùn)算效率。

表2 擬比對(duì)CNN、CNN與BLAST方法的計(jì)算時(shí)間比較Table2 Computation time comparisons of the quasi alignment CNN、CNN and BLAST algorithms ms

4 結(jié)語

本研究以癌癥生物標(biāo)志物p53基因?yàn)閷?duì)象，通過NCBI一級(jí)數(shù)據(jù)庫收集p53癌癥基因序列，經(jīng)過解析與歸納將二級(jí)數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)為包含p53信息、癌癥信息、樣本信息和參考文獻(xiàn)信息等4個(gè)部分，利用5個(gè)功能模塊更加有利于實(shí)現(xiàn)二級(jí)數(shù)據(jù)庫的信息查詢與使用。為了進(jìn)一步提高CNN序列比對(duì)方法相似度的敏感性和可靠性，本文對(duì)相似度評(píng)估公式進(jìn)行改進(jìn)，并將其定義為擬比對(duì)CNN方法，有效提高了算法的性能。采用擬比對(duì)CNN方法對(duì)乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌p53基因的外顯子序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)兩種癌癥p53基因的Exon5序列突變存在較大差異，可作為區(qū)別乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的參考標(biāo)準(zhǔn)。

后續(xù)將增加更多癌癥p53基因，以及加入某種癌癥的其他生物標(biāo)志物比如乳腺癌的HER2、ER，結(jié)直腸癌的EGFR、KRAS等，使數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容更全面，實(shí)用性更強(qiáng)，應(yīng)用性更廣。