高效降解嘌呤核苷乳酸菌的篩選及特性研究

麻菊美 ，趙偉睿 ，胡 升 ， 王 康 ，黃俊，鄭曉冬，金志華，梅樂和*

（1.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州310027；2.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波315100；3.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058；4.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州310023）

尿酸是人體內(nèi)嘌呤核苷酸的代謝終產(chǎn)物，高尿酸血癥是由于人體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，繼而導(dǎo)致血液中尿酸含量超出正常水平的代謝性疾病。增高的血尿酸會結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)、腎盂、輸尿管、腎間質(zhì)等處，引起痛風(fēng)、尿酸鹽腎病、尿酸性尿路結(jié)石等疾病的發(fā)生，嚴(yán)重時可導(dǎo)致關(guān)節(jié)致殘和腎功能不全[1-5]。此外，高尿酸血癥也是多種疾病的危險因素，常與心血管疾病、慢性腎臟病及代謝綜合征（糖尿病、胰島素抵抗和肥胖）等并發(fā)[1-5]。近年來，隨著人們物質(zhì)生活的豐富，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化，高尿酸血癥及其相關(guān)病癥發(fā)病率在我國快速增加，已成為現(xiàn)代人的高發(fā)疾病之一[2]。高尿酸血癥的治療與預(yù)防除了使用藥物外，一般還需要對飲食進(jìn)行控制，盡量降低嘌呤核苷的攝入量[3，6]。然而高嘌呤食物種類眾多，如紅肉、海鮮類、肝臟類、禽類、啤酒等，因此，控制飲食將會很難維持食物提供的營養(yǎng)素平衡[7]。此外，限制嘌呤核苷的攝入還需要限制雞精（其主要鮮味物質(zhì)為鳥苷酸二鈉和肌苷酸二鈉等嘌呤核苷）等鮮味劑的攝取，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

隨著乳酸菌對人體的益生作用越來越受到關(guān)注與重視，人們也開始采用乳酸菌對高尿酸血癥進(jìn)行輔助治療和預(yù)防[8-10]。通過口服可有效分解嘌呤核苷的乳酸菌，讓其在腸道內(nèi)分解食物中的嘌呤核苷，降低腸道對嘌呤核苷的吸收量，繼而降低血尿酸的水平[8-10]。因此，用乳酸菌對高尿酸血癥進(jìn)行輔助治療和預(yù)防可以避免或減輕嚴(yán)格飲食限制對患者生活質(zhì)量的影響。目前，日本科學(xué)家已篩選得到幾株具有較高嘌呤核苷降解能力的菌株，并通過動

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

市售泡菜；MRS肉湯、抗菌藥物藥敏紙片、O-F生化管（腸桿菌科），杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品； 胃蛋白酶（Pepsin 1：3000 from Porcine Stomach）、胰蛋白酶（Trypsin 1：250 from Porcine pancreas）、牛膽粉、L-半胱氨酸、肌苷、鳥苷，生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；乳酸菌微量生化鑒定條，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 高效降解嘌呤核苷菌株的篩選 將市售泡菜充分混勻后，吸取泡菜汁，用0.9 g/dL NaCl無菌水溶液稀釋合適的倍數(shù)后，涂布在MRS固體平板上，30℃靜置培養(yǎng)48 h，獲得單菌落。降解嘌呤核苷菌株的篩選按Tsuboi等[9]的方法進(jìn)行：從平板上挑取單菌落，接種于MRS培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)24 h。以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量傳代2次活化菌種，作為種子培養(yǎng)基。將種子培養(yǎng)基以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)48 h后，取2 mL培養(yǎng)液，于4℃、4000 r/min離心10 min物實驗證明了這些菌株具有輔助降低血尿酸的作用[8-10]。而目前，我國在這方面的研究還鮮有報道。本研究從市售泡菜中分離出一株具有高效降解嘌呤核苷能力的乳酸菌，并通過藥敏譜、耐酸、耐膽鹽和人工胃腸液耐受性等實驗來研究其特性，以期為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高尿酸血癥輔助治療微生態(tài)菌劑奠定基礎(chǔ)。收集菌體。用無菌的0.9 g/dL NaCl溶液清洗菌體2次。向清洗后的菌體中加入750 mL的反應(yīng)液（含有12.6 mmol/L肌苷和12.6 mmol/L鳥苷的0.1 mol/L、pH 7.0 K3PO4溶液），重懸菌體后置于恒溫混勻儀中（37℃、800 r/min）反應(yīng)1 h。反應(yīng)后迅速將反應(yīng)液置于沸水浴中5 min，終止反應(yīng)。10000 r/min離心2 min，除去菌體，收集上清液。測定上清液中肌苷和鳥苷的濃度。按如下公式計算肌苷和鳥苷的降解率：

式中：C為質(zhì)量濃度（g/L）。

1.2.2 肌苷和鳥苷含量的測定 采用HPLC法測定反應(yīng)液中肌苷和鳥苷的含量[11]。色譜條件：Hitachi（日立）LC2000高效液相色譜；反相色譜柱為Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm）； 流動相為0.01 mol/L KH2PO4溶液∶甲醇=5∶95（體積比），流速為1 mL/min，柱溫為30℃，測定波長為260 nm。

1.2.3 乳酸菌的鑒定 O-F反應(yīng)和糖類利用能力試驗分別按相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。16S rDNA同源比較鑒定：將純化好的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit試劑盒提取菌體基因組，并用PCR擴(kuò)增其16S rDNA的基因片段。擴(kuò)增引物序列為 ，16sF：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，16sR：GGCTACCTTGTTACGACTT。將擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析[12]。

1.2.4 菌株生長曲線的測定 將活化好的菌株，以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)。測定不同生長時間的菌體OD600值和培養(yǎng)液的pH值，以時間為橫坐標(biāo)，OD600和pH為縱坐標(biāo)建立坐標(biāo)系。

1.2.5 藥敏性試驗 將200 μL菌體培養(yǎng)液均勻涂布到MRS固體平板上，在每個平板上放置3片藥物敏感紙片，30℃培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.6 耐酸試驗 將活化好的菌株分別置于pH為6.2（對照組）、2、3和 4的 MRS培養(yǎng)基中，30 ℃下處理1、2、3 h和4 h后進(jìn)行平板活菌計數(shù)。

1.2.7 耐膽鹽試驗 將活化好的菌株分別置于牛膽粉質(zhì)量濃度分別為 0（對照組）、0.1、0.2、0.3、0.6 g/dL和0.9 g/dL的MRS培養(yǎng)基中，30℃下處理1、2、3 h和4 h后進(jìn)行平板活菌計數(shù)。

1.2.8 乳酸菌對人工消化液的耐受性測定 分別考察乳酸菌在空腹和飽腹?fàn)顟B(tài)下對人工消化液的耐受性，按KHALIL等[13]的方法進(jìn)行，配置相關(guān)人工消化液。

營養(yǎng)液：阿拉伯半乳糖、膠質(zhì)、木聚糖、土豆淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、粘蛋白、L-半胱氨酸，分別為 1、2、1、3、0.4、3、1、4、0.5 g/L。

人工胃液：3.33 g/dL胃蛋白酶，pH為2或3。人工腸液（g/L）：NaHCO3為 12.5，膽鹽為 6.0，胰酶為0.9，pH為6.8。

空腹?fàn)顟B(tài)：不加營養(yǎng)液的人工胃液（pH 2）和人工腸液。

飽腹?fàn)顟B(tài)：加有營養(yǎng)液成分的人工胃液（pH 3）和人工腸液。

人工消化液（空腹和飽腹兩個狀態(tài)）耐受性的測定：取30℃靜置培養(yǎng)30 h的菌液1 mL，4℃、4000 r/min離心10 min，去掉上清液，將菌體懸浮于1 mL的人工胃液中處理2 h（37℃，800 r/min）；離心菌體，棄上清液，將菌體懸浮在1 mL人工腸液中處理 2 h（37 ℃，800 r/min）后，進(jìn)行菌落計數(shù)，原菌液作對照。

1.2.9 乳酸菌在飽腹的人工腸液中嘌呤核苷降解能力的測定 離心收集2 mL菌體培養(yǎng)液，用滅菌生理鹽水洗滌2次，將菌體懸浮于750 mL肌苷和鳥苷濃度都為12.6 mmol/L的飽腹人工腸液和緩沖液中反應(yīng)（37℃，800 r/min），于 1 h后測定肌苷和鳥苷的降解率。對照組不加菌體。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效降解嘌呤類核苷乳酸菌的篩選

從泡菜樣品中分離出80株菌，對它們的嘌呤核苷降解能力測定后發(fā)現(xiàn)，所挑選的菌株均具有一定的嘌呤核苷降解能力，但不同菌株之間的降解能力存在明顯的差異，表1列出降解能力較強(qiáng)的菌株，其中菌株5-1具有最高的肌苷和鳥苷降解率，分別達(dá)到89.37%和93.20%，略低于YAMADA等[8-10]所報道菌株的降解能力。此外，從表1的結(jié)果也可以看出這些菌株對肌苷和鳥苷的降解效果成正相關(guān)，這與YAMADA等[8-10]的研究結(jié)果相一致。

2.2 菌株5-1的菌種鑒定

2.2.1 菌株5-1的O-F反應(yīng)和糖類利用能力測定結(jié)果 從糖類利用特性來看，菌株 5-1與《伯杰氏細(xì)菌手冊（第八版）》中描述的彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）基本相同，因此，菌株 5-1初步鑒定為彎曲乳桿菌。

表1 不同菌株對肌苷和鳥苷的降解率Table1 Determination of insosine and guanosine decomposition results of different strains

2.2.2 菌株5-1的16S rDNA測序結(jié)果 菌株5-1的16S rDNA測序結(jié)果如圖1所示，將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)菌株5-1的16S rDNA與Lactobacillus curvatusstrain JMC1096的同源性高達(dá)99%，從數(shù)據(jù)庫中獲得9種不同菌株的16S rDNA基因序列，與菌株5-1的16S rDNA序列一起，用Clustalx+PHYLIP+NJplot軟件進(jìn)行比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，從系統(tǒng)發(fā)育樹可知菌株5-1與Lb.curvatus位于同一個簇群（圖2），結(jié)合上面的糖類利用實驗可以判斷菌株5-1屬于Lb.curvatus。

圖1 Lb.curvatus 5-1的16S rDNA測序結(jié)果Fig.1 16S rDNA sequencing results of Lb.curvatus 5-1

2.3 Lb.curvatus 5-1的生長曲線測定結(jié)果

對Lb.curvatus5-1的生長曲線進(jìn)行測定，從圖3可看出Lb.curvatus5-1在5～18 h處于對數(shù)生長期，這時期菌體生長速度最快，乳酸大量生成（發(fā)酵液pH迅速降低）。18 h后，菌體生長進(jìn)入平臺期，此時菌體生長速度減緩，趨于穩(wěn)定，發(fā)酵液pH維持在4左右，說明菌株產(chǎn)酸能力在進(jìn)入平臺期后受到了抑制。此外，在74 h以內(nèi)發(fā)酵液OD600值都能維持比較穩(wěn)定的狀態(tài)，從側(cè)面說明該菌株具有較強(qiáng)的生命力和耐酸能力。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

了解乳酸菌的藥敏譜，是益生菌安全使用的前提[14-15]。從表3結(jié)果可看出，Lb.curvatus5-1對不同的抗生素表現(xiàn)出了不同的敏感性，對苯唑西林、頭孢氨芐、四環(huán)素類（米諾環(huán)素除外）、氨基糖苷類、碳青霉烯類、喹諾酮類、糖肽類、單環(huán)內(nèi)酰胺類、氯霉素和利福平比較不敏感，抑菌圈直徑與藥紙片直徑（（5.32±0.23） mm）一致，而對頭孢類的頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢呋辛和頭孢唑林及青霉素類的氨芐西林、哌拉西林和羧芐西林則比較敏感，抑菌圈直徑在17 mm以上。

圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of isolate and sequences of relating species

圖3 Lb.curvatus 5-1在MRS培養(yǎng)基中的菌體生長情況和pH變化情況Fig.3 Lb.curvatus 5-1’s growth curve and the change of pH in MRS

表3 Lb.curvatus 5-1對不同種類的抗生素敏感性結(jié)果Table3 Results of sensitivity of Lb.curvatus 5-1 to different kinds of antibiotics

2.5 Lb.curvatus 5-1耐酸、耐膽鹽及人工胃腸液耐受性結(jié)果

2.5.1Lb.curvatus5-1耐酸和耐膽鹽能力試驗結(jié)果 乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮良好的生理功能，關(guān)鍵是要能耐受不利于其生存的體內(nèi)環(huán)境，尤其是胃酸和膽鹽。胃酸的pH波動比較大，空腹或食用酸性食品時pH可達(dá)1.5～2.0，食用堿性食物時pH可達(dá)4.0～5.0，而通常 pH 為 3.0[16-18]。Lb.curvatus5-1 的耐酸能力如圖4所示，雖然pH 2.0的酸性環(huán)境對其存活有較大影響，但在pH 3.0的條件下處理4 h該菌株能夠保持1×107cfu/mL以上的活菌數(shù)；而通常胃酸pH在3.0左右，食物通過胃的時間一般為1～2 h[17]，由此可說明，Lb.curvatus5-1 具備了抵抗多數(shù)條件下人體酸性環(huán)境的能力。

乳酸菌對膽鹽具有良好的耐受性是它能夠在腸道中存活、生長和發(fā)揮功效的另一個重要特性。人體小腸中膽汁的質(zhì)量濃度范圍在0.03～0.3 g/dL[17]。能在正常生理膽鹽質(zhì)量濃度中生長和進(jìn)行代謝的乳酸菌被認(rèn)為是能在腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程中存活[19]。由圖5可知，在膽鹽質(zhì)量濃度≤0.3 g/dL時，Lb.curvatus5-1的活菌數(shù)保持在1×107cfu/mL以上，說明Lb.curvatus5-1可以耐受人體正常膽汁質(zhì)量濃度，具備在腸道中生存所需的膽鹽耐受能力。

圖4 Lb.curvatus 5-1對酸的耐受能力Fig.4 Acid tolerance of Lb.curvatus 5-1

圖5 Lb.curvatus 5-1對膽鹽的耐受能力Fig.5 Bile salt tolerance of Lb.curvatus 5-1

2.5.2人工胃腸液耐受性 乳酸菌能順利到達(dá)腸道并在腸道中存活是其發(fā)揮益生功能的關(guān)鍵，從圖6可以看出，雖然在空腹時Lb.curvatus5-1存活能力不高，活菌數(shù)只有1×103cfu/mL左右，但在飽腹?fàn)顟B(tài)下，Lb.curvatus5-1表現(xiàn)出比較強(qiáng)的存活能力，活菌數(shù)在1×107cfu/mL以上，明顯高于活性乳桿菌在腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用所要求的菌體數(shù)（1×106cfu/mL）[20]。說明Lb.curvatus5-1適宜在飯后服用，以便使其能更好地發(fā)揮益生功能。

圖6 Lb.curvatus 5-1在人工胃腸液處理后的活菌數(shù)Fig.6 Survival rate of Lb.curvatus 5-1 after treatment of artificial gastrointestinal tract

2.5.3Lb.curvatus5-1在飽腹的人工腸液中嘌呤核苷的降解效果 小腸是乳酸菌降解嘌呤核苷的場所，因此本研究考查了Lb.curvatus5-1在飽腹人工腸液中對嘌呤核苷的降解能力。從表4中可知，與在緩沖液中（表1）一樣，Lb.curvatus5-1在飽腹人工腸液中同樣展現(xiàn)出了高效的肌苷和鳥苷降解能力。

表4 腸道消化模擬條件下Lb.curvatus 5-1對肌苷和鳥苷的降解率Table4 Degradation rate of Lb.curvatus 5-1 to insosine and guanosine under the artificial intestinal tract with food suspension condition

3 結(jié)語

采用乳酸菌對高尿酸血癥進(jìn)行輔助治療和預(yù)防，可以避免或者減輕飲食的嚴(yán)格限制，從而減輕嚴(yán)格飲食限制對患者生活質(zhì)量的影響。本研究從市售泡菜中篩選出一株具有高效降解嘌呤核苷能力的乳酸菌5-1，并通過生理生化和16S rDNA對其進(jìn)行鑒定，確定其屬于Lactobacillus curvatus。該菌不僅具有良好的耐酸和耐膽鹽能力，能耐受飽腹的人工胃腸液，而且在飽腹的人工腸液中表現(xiàn)出了高效的嘌呤核苷降解能力。因此，Lb.curvatus5-1在輔助治療和預(yù)防高尿酸血癥及其相關(guān)疾病方面具有良好的應(yīng)用前景。