矮牽牛PhPYL4基因的克隆與表達(dá)分析

董 冬，王雪娣，劉同瑞，尹 偉，謝 宛，董麗麗

(1.淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院/資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽淮南 232038；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥 230036)

逆境脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，如干旱和鹽等非生物脅迫[1-2]。因此，培育抗逆性強(qiáng)的植物新品種對(duì)提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、提升生產(chǎn)效率以及節(jié)約利用水和土地等自然資源均具有重要意義。脫落酸(Abscisic acid,ABA)作為一類(lèi)重要的植物激素，不但參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，如種子萌發(fā)和休眠、開(kāi)花、氣孔關(guān)閉等，還能夠參與植物的多種逆境脅迫[3-4]。

PYRABACTIN RESISTANCE1(PYR1)/PYR1-LIKE(PYL)/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS(RCAR)是最先在擬南芥中鑒定的ABA受體，在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[5-6]。研究表明 PYR1/PYLs/RCAR家族共有14個(gè)成員，分別命名為PYR1和PYL1-13(RCAR1- RCAR14)。其中，PYL4被認(rèn)為是泛素化蛋白[7]，能夠與RING FINGER OF SEED LONGEVITY1(RSL1)相互作用，且RSL1促進(jìn)其體內(nèi)降解[8]。而FYVE1/FREE1能夠與PYL4相互作用，介導(dǎo)其向液泡降解途徑的傳遞[9]。此外，轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：擬南芥PYL4的過(guò)量表達(dá)能夠提高植物的抗旱性[10]，煙草NtPYL4在毛狀根中的過(guò)表達(dá)引起生物堿積累的下降[11]。上述研究結(jié)果表明PYL4參與植物的抗逆及次生代謝過(guò)程。然而，PYL4是否參與矮牽牛對(duì)植物的逆境脅迫響應(yīng)，目前并不清楚。

矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)是一種重要的園林觀(guān)賞植物和模式植物，培育抗逆性強(qiáng)的新品種是矮牽牛育種的重要方向。本研究從矮牽牛中分離PYL4的同源基因，并對(duì)該基因的生物學(xué)信息及其在不同組織及不同逆境處理下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。以期為豐富PYL4調(diào)控植物的抗逆機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)，并為培育抗逆性強(qiáng)的矮牽牛新品種提供基因儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將供試材料矮牽牛W115系(Petunia×hybrida‘Mitchell’)實(shí)生苗種植于組培室中，培養(yǎng)條件：晝夜溫度為25 ℃/23 ℃，光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-2，光周期為16 h/8 h。

1.2 PhPYL4的克隆

根據(jù)公布的腋花矮牽牛(Petuniaaxillaris)基因組序列(https:∥solgenomics.net/)，分別設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物PYL4-F:ATGCTTCCTAATTCTC AAAGCTCAT和PYL4-R:TCAAGTAGCCTTTCTTCTGCTCAAA。將矮牽牛葉片經(jīng)液氮研磨后，使用TRIzol(Invitrogen，美國(guó))試劑提取RNA，選取OD260/OD280>1.8且無(wú)降解的RNA，使用TransScript○ROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。使用高保真酶KOD-Plus-Neo(TOYOBO，日本)進(jìn)行擴(kuò)增獲得PhPYL4序列。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)。將克隆獲得的序列連接到pEASY-Blunt Simple載體(全式金)，鑒定陽(yáng)性克隆送由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 6.0軟件對(duì)蛋白相似性比進(jìn)行分析。使用Protparam tool (http:∥web.Expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、分子式、氨基酸組成及疏水性等進(jìn)行分析。使用Clustal X 2.0和MEGA 5.0等軟件進(jìn)行蛋白遺傳聚類(lèi)分析。

1.4 PhPYL4的表達(dá)分析

表達(dá)分析試驗(yàn)均以30 d株齡的矮牽牛作為試材。分別取矮牽牛的根、嫩莖、葉片，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于PhPYL4的組織特異性表達(dá)分析；將矮牽牛幼苗根系于8:00置于含有200 mmol·L-1NaCl的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液中[12]，分別于處理12 h和24 h后取葉片，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，用于鹽脅迫下PhPYL4表達(dá)水平的檢測(cè)；將矮牽牛幼苗根系于8:00置于含有體積分?jǐn)?shù)為10% PEG-6000(Polyethylene Glycol 6000)的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液中[12]，分別于12 h和24 h后取葉片，提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于干旱脅迫下PhPYL4基因的表達(dá)水平分析；于8:00對(duì)矮牽牛葉面噴施ABA(Abscisic acid，50 μmol·L-1)[13]，分別于12 h和24 h后取葉片，提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于檢測(cè)ABA處理下基因的表達(dá)水平。以上所有試驗(yàn)每個(gè)處理取10株苗，并設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

為獲得的PhPYL4的全長(zhǎng)序列作為參考，利用Primer primer 5軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物：PYL4-RT-F:TAAACCACCTCAACAACTACAA，PYL4-RT-R:AACAAAAACACACG- TCTCATCC。取2 μg RNA，使用TransScript○ROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板。按照ChamQTMUniversal SYBR○RqPCR Master Mix(諾唯贊)的操作步驟，分別使用ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和7500軟件(version 2.0.4)進(jìn)行熒光定量PCR和數(shù)據(jù)分析。以矮牽牛ACTIN作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PhPYL4基因全長(zhǎng)序列的克隆及序列分析

根據(jù)已經(jīng)公布的腋花矮牽牛基因組序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得PhPYL4的cDNA序列(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，PhPYL4基因序列全長(zhǎng)為645 bp，共編碼214個(gè)氨基酸。推測(cè)PhPYL4蛋白的分子質(zhì)量為23.60 ku，等電點(diǎn)為8.67，分子式為C1022H1662N306O316S10，不穩(wěn)定系數(shù)為43.62，脂溶指數(shù)為89.11，親水性平均值(GRAVY)為 -0.239。該蛋白中相對(duì)含量較多的氨基酸依次為Val (11.7%)、Thr (9.3%)、Ser (8.4%)、Arg (7.0%)、Ile (6.5%)、Leu (6.5%)。總的帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)為18個(gè)，總的帶正電荷的殘基(Arg+Lys)為22個(gè)。

M.DL2000

2.2 PhPYL4蛋白的序列分析

將PhPYL4推測(cè)的蛋白序列與已公布的煙草、苜蓿、蓖麻、擬南芥等蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，序列相似性分別為91.63%、68.22%、62.44%和 57.08%(圖2)，推測(cè)PhPYL4是PYL4的同源蛋白。利用NCBI Conserved Domains軟件對(duì)PhPYL4序列進(jìn)行分析，PhPYL4序列具有保守的疏水性配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，隸屬于SRPBCC(START/RHOalphaC/PITP/Betv1/CoxG/CalC)超家族，推測(cè)可能具有該基因家族的生物學(xué)功能 (圖3)。

NaPYL4.煙草(XP_019243979)Nicotianatabacum(XP_019243979)；MtPYL4.苜蓿(XP_003623366.1)Medicagotruncatula(XP_003623366.1)；RcPYL4.蓖麻(XP_002526675.1)Ricinuscommunis(XP_002526675.1)；PYL4.擬南芥(NP_565887.1)Arabidopsisthaliana(NP_565887.1)

圖2 PhPYL4與其他物種PYL4的比對(duì)
Fig.2 Alignment of PhPYL4 with other PYL4

圖3 PhPYL4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Structure domain analysis of PhPYL4

2.3 PhPYL4的系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究PhPYL4與其他物種中PYL4的親緣關(guān)系，利用MEGA 5.0軟件，將矮牽牛PhPYL4與已公布的煙草、楊樹(shù)、向日葵、裂葉牽牛、棉花、黃瓜等15個(gè)物種的PYL4序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明：PhPYL4與其他物種中的PYL4起源相同，但在進(jìn)化的不同時(shí)期逐漸與其他物種分離開(kāi)來(lái)。PhPYL4和煙草NtPYL4聚為一枝，親緣關(guān)系最近，而與胡楊PePYL4和橡膠HbPYL4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

2.4 PhPYL4的組織特異性表達(dá)分析

為研究PhPYL4的表達(dá)特性，利用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)PhPYL4在矮牽牛不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。如圖5所示：PhPYL4在矮牽牛的根、莖、葉中均有表達(dá)。PhPYL4的表達(dá)水平從高到低依次為：葉>莖>根。葉片中的表達(dá)量約為根中的14倍，而莖中的表達(dá)量約為根中的6倍。說(shuō)明PhPYL4的表達(dá)具有明顯的組織特異性。

圖中的分支點(diǎn)數(shù)字表示基于500次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)的自展支持率 The nodes in the figure show the bootstrap values based on 500 replications; 標(biāo)尺代表遺傳距離 The scale represents the genetic distance；PePYL4.胡楊 (XP_011019068.1)Populuseuphratica(XP_011019068.1); HbPYL4.橡膠 (XP_021669328.1)Heveabrasiliensis(XP_021669328.1); CsPYL4.黃瓜 (XP_004148626.1)Cucumissativus(XP_004148626.1); GaPYL4.棉花 (XP_017603732.1)Gossypiumarboreum(XP_017603732.1); TcPYL4.可可 (XP_007026589.1)Theobromacacao(XP_007026589.1); OePYL4.橄欖 (XP_022882332.1)Oleaeuropaea(XP_022882332.1); SiPYL4.芝麻 (XP_011095066.1)Sesamumindicum(XP_011095066.1); HaPYL4.向日葵 (XP_021987876.1)Helianthusannuus(XP_021987876.1)；LsPYL4.萵苣(XP_023760467.1)Lactucasativa(XP_023760467.1)；CaPYL4.辣椒 (XP_016543230.1)Capsicumannuum(XP_016543230.1); InPYL4.裂葉牽牛 (XP_019161230.1)Ipomoeanil(XP_019161230.1); StPYL4.馬鈴薯(XP_006363617.1)Solanumtuberosum(XP_006363617.1);NtPYL4.煙草(XP_016465801.1)Nicotianatabacum(XP_016465801.1); DcPYL4.胡蘿卜 (XP_017253785.1)Daucuscarota(XP_017253785.1)；EsPYL4.山俞菜 (XP_006411045.1)Eutremasalsugineum(XP_006411045.1)

圖4 不同物種PYL4的系統(tǒng)進(jìn)化分析
Fig.4 Phylogenetic analysis among different PYL4

圖5 矮牽牛不同組織 PhPYL4的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of PhPYL4 in different tissues of Petunia

2.5 PhPYL4在不同脅迫下的表達(dá)分析

2.5.1 鹽脅迫 為研究鹽脅迫對(duì)PhPYL4的調(diào)控，對(duì)矮牽牛進(jìn)行NaCl處理，分別于處理后 12 h和24 h對(duì)PhPYL4的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以置于營(yíng)養(yǎng)液中的矮牽牛作為對(duì)照。結(jié)果表明：鹽脅迫處理12 h后，PhPYL4的表達(dá)水平迅速上調(diào)為對(duì)照的6倍，而24 h后PhPYL4的表達(dá)水平逐漸下降為對(duì)照的4倍(圖6)。說(shuō)明PhPYL4參與了矮牽牛鹽脅迫應(yīng)答途徑。

圖6 PhPYL4在鹽脅迫下的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of PhPYL4 under salt stress

2.5.2 干旱脅迫 研究表明PYL的多個(gè)家族成員經(jīng)過(guò)表達(dá)后提高了干旱脅迫耐性，為揭示PhPYL4是否能夠響應(yīng)干旱脅迫，分別在PEG模擬干旱處理12 h和24 h后檢測(cè)該基因的表達(dá)水平，以置于營(yíng)養(yǎng)液中的矮牽牛作為對(duì)照。結(jié)果顯示：10% PEG-6000處理12 h后，PhPYL4的表達(dá)水平上升至對(duì)照的13倍。而處理24 h后，PhPYL4的表達(dá)水平為對(duì)照的10倍，相對(duì)于12 h時(shí)，表達(dá)水平有所下降(圖7)，說(shuō)明干旱脅迫能夠顯著誘導(dǎo)PhPYL4的表達(dá)。

圖7 PhPYL4在模擬干旱脅迫下的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of PhPYL4 under drought stress

2.5.3 ABA處理 為研究ABA對(duì)PhPYL4的調(diào)控作用，分別在葉面噴施50 μmol/L ABA，于12 h和24 h后檢測(cè)該基因的表達(dá)水平,并以未噴施ABA的矮牽牛作為對(duì)照。結(jié)果(圖8)顯示：ABA處理12 h后，PhPYL4的表達(dá)水平上調(diào)至對(duì)照的29倍。而處理24 h后，PhPYL4的表達(dá)水平為對(duì)照的11倍，相對(duì)于12 h時(shí)，表達(dá)水平顯著下降。說(shuō)明PhPYL4能夠顯著響應(yīng)ABA信號(hào)的誘導(dǎo)，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，響應(yīng)減弱。

圖8 PhPYL4在ABA處理下的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of PhPYL4 under ABA treatment

3 討 論

近年來(lái)，PYR/PYL/RCAR家族成員在毛果楊[15]、水稻[16]、短柄草[17]和棉花[18]等多個(gè)物種中得以鑒定，并被證明參與了干旱、鹽及寒冷等非生物脅迫響應(yīng)。本研究中，克隆了矮牽牛PhPYL4的全長(zhǎng)序列，通過(guò)對(duì)PhPYL4蛋白序列的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PhPYL4具有一個(gè)保守的疏水性配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。相關(guān)研究表明，該結(jié)構(gòu)域是PP2C蛋白磷酸酶的結(jié)合位點(diǎn)，PP2Cs能夠與ABA受體相互作用從而抑制其活性[19]，并激活下游路徑。通過(guò)序列比對(duì)顯示，PhPYL4與蓖麻、苜蓿等物種同源序列的整體相似性為 70.84%，表明PYL4在不同物種間具有較高的保守性。PhPYL4的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PhPYL4與同科物種煙草NtPYL4親緣關(guān)系最近。綜合以上結(jié)果，可以證實(shí)所克隆的PhPYL4屬于PYR/PYL/RCAR蛋白家族成員，為PYL4的同源基因。

組織特異性表達(dá)分析顯示，PhPYL4在莖、葉片、根中均有表達(dá)，而在葉片中的表達(dá)量最高，顯著高于莖和根，這與杜梨PbPYL4在根、莖、葉中表達(dá)量差異較小的研究結(jié)果不同[20]，說(shuō)明PYL4在不同物種中的表達(dá)特性存在差異。對(duì)矮牽牛進(jìn)行鹽脅迫處理，結(jié)果顯示PhPYL4的表達(dá)水平在12 h時(shí)上調(diào)，24 h時(shí)開(kāi)始下降，說(shuō)明PhPYL4參與了矮牽牛對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。然而，對(duì)杜梨的研究發(fā)現(xiàn)：鹽脅迫12 h時(shí)，葉片與根中PbPYL4表達(dá)量均上調(diào)，鹽脅迫24 h時(shí)，根中PbPYL4表達(dá)量下降，而葉片中PbPYL4直到72 h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始下降[20]。此外，對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫引起PYL4表達(dá)量的下調(diào)[21]。綜合上述不同的研究結(jié)論，推測(cè)不同物種中PYL4的作用機(jī)制并不相同。PGE及外源ABA處理下，PhPYL4的表達(dá)水平同樣呈現(xiàn)先上升(12 h)后下降(24 h)的趨勢(shì)，說(shuō)明PhPYL4能夠快速對(duì)干旱及ABA處理作出應(yīng)答。但PhPYL4的變化趨勢(shì)與干旱及ABA處理引起擬南芥PYL4表達(dá)量下調(diào)的結(jié)果相反。然而，PYR1基因在鹽、模擬干旱脅迫及ABA處理下分別上調(diào)了6.73、 14.72、10.78倍[21]，這與矮牽牛PhPYL4對(duì)3種逆境條件下的響應(yīng)趨勢(shì)相似。該研究結(jié)果說(shuō)明PYR/PYL/RCAR家族成員在不同物種中的作用機(jī)制不同。

綜合上述研究結(jié)果，PhPYL4參與了矮牽牛響應(yīng)干旱、鹽脅迫及ABA信號(hào)途徑,在調(diào)控矮牽牛的逆境響應(yīng)機(jī)制中具有重要作用，但詳細(xì)的分子調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步探索。該研究為后續(xù)揭示PhPYL4的功能奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為培育抗逆性強(qiáng)的矮牽牛新品種提供了候選基因。