兩個(gè)‘黃冠梨’雜交F1代對(duì)白粉病抗性的遺傳傾向

張艷杰，王 斐，歐春青，方 明，趙亞楠，馬 力，姜淑苓

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100)

梨是薔薇科(Rosaceae)、梨屬(Pyrus)水果作物，可分為亞洲梨和歐洲梨[1]，生產(chǎn)上的栽培品種主要屬于白梨(P.bretschneideri)、秋子梨(P.ussuriensis)、砂梨(P.pyrifolia)、新疆梨(P.sinkiangensis)和西洋梨(P.communis)等[2]。

白粉病是梨樹葉部主要病害之一，在中國各主要梨區(qū)均有發(fā)生，且近幾年有加重的趨勢(shì)，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，對(duì)葉片光合作用和蒸騰作用影響極大，造成葉片提早脫落，嚴(yán)重影響樹勢(shì)和產(chǎn)量[3]。梨樹白粉病病原菌有白叉絲單囊殼(Podosphaeraleucotricha)[4-5]、隱蔽叉絲單囊殼(P.clandestina)[6]、P.paracurvispora[7]和梨球針殼(Phyllactiniapyri)[8]等。

培育和栽植抗白粉病品種，是防治梨樹白粉病最根本、最有效的措施，但是梨樹童期較長，雜交育種的選擇周期長，對(duì)于抗病性等特征進(jìn)行分子輔助育種的早期篩選，可以降低后期性狀觀察的工作量，甚至縮短育種進(jìn)程[9]。本研究以田間自然發(fā)病抗性調(diào)查為基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)‘早酥梨’ב黃冠梨’和‘錦豐梨’ב黃冠梨’兩個(gè)雜交組合F1代對(duì)梨樹白粉病的抗性，并分析白粉病抗性遺傳傾向，篩選抗病材料，旨在為梨樹抗病新品種選育提供科學(xué)依據(jù)，為梨樹抗白粉病相關(guān)基因鑒定和定位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 梨樹雜交組合材料

試驗(yàn)材料‘早酥梨’ב黃冠梨’和‘錦豐梨’ב黃冠梨’兩個(gè)雜交組合F1代定植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所(興城)，常規(guī)管理。

1.2 梨樹白粉病病原菌鑒定

當(dāng)梨樹白粉病葉片產(chǎn)生黑色小顆粒(子囊果)時(shí)，采集梨樹白粉病葉片，顯微鏡下觀察黑色小顆粒的形態(tài)特征，初步進(jìn)行白粉病菌的形態(tài)鑒定；刮取病葉上的白粉病菌，采用Chelex-100法提取白粉病菌DNA，以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]，將擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，以對(duì)白粉病菌進(jìn)行分子鑒定。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中：DNA模板溶液(50 ng/μL)2 μL，10×Taq10 buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs溶液0.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，Taq10 DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 梨樹白粉病田間調(diào)查

分別于2017年9月和2018年9月進(jìn)行兩個(gè)黃冠梨雜交組合F1代田間白粉病自然發(fā)病調(diào)查，單株調(diào)查葉片100個(gè)，根據(jù)白粉病病斑面積占葉片總面積的百分比記錄病級(jí)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]為：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積在5%及以下(0除外)；2級(jí)，病斑面積在5%以上，15%及以下；3級(jí)，病斑面積在15%以上，30%及以下；4級(jí)，病斑面積在30%以上，45%及以下；5級(jí)，病斑面積在45%以上，65%及以下；6級(jí)，病斑面積在65%以上，85%及以下；7級(jí)，病斑面積在85%以上。感病指數(shù)(SI)按照以下公式計(jì)算：

感病指數(shù)(SI)=∑(病級(jí)代表值×該級(jí)病葉數(shù))/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值)×100

最后取兩年感病指數(shù)的平均值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)葉片感病指數(shù)，評(píng)價(jià)梨樹對(duì)白粉病的抗性程度[11]：SI=0，不感病(I)；0

1.4 雜交后代抗白粉病遺傳傾向分析

將親本和雜交F1代兩年的白粉病調(diào)查數(shù)據(jù)錄入Excel表格，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算感病指數(shù)，取兩年的平均值，并用平均值進(jìn)行以下分析，計(jì)算雜交F1代群體感病指數(shù)的中親值(MP)、變異系數(shù)(CV)、遺傳傳遞力(Ta)、優(yōu)勢(shì)率(H)等，分析F1代對(duì)白粉病抗性的遺傳傾向[12]。

變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)差/F×100%；遺傳傳遞力(Ta)=F/MP×100%；優(yōu)勢(shì)率(H)=F-MP/0.5(P1+P2)×100%。(公式中的F為雜交后代平均值，MP為中親值，P1和P2為親本值)

2 結(jié)果與分析

2.1 梨樹白粉病病原菌鑒定

顯微形態(tài)觀察顯示，梨樹白粉病病原菌子囊果扁圓球形，黑褐色，無孔口，附屬絲針狀，基部膨大呈球形，子囊內(nèi)有2個(gè)子囊孢子，子囊孢子長橢圓形，單胞，無色或淡黃色，具有典型梨球針殼(P.pyri)的特征[6](圖1)，將梨樹白粉病菌初步鑒定為梨球針殼(P.pyri)。擴(kuò)增白粉病菌ITS片段獲得一段679 bp的序列，在NCBI上進(jìn)行BLASTn比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與P.pyri的ITS序列(GenBank GU984780.1)一致性為99%。綜合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果，將梨樹白粉病菌鑒定為梨球針殼(P.pyri)。

2.2 雜交F1代白粉病抗性分析

2017年和2018年試驗(yàn)地梨樹白粉病發(fā)生較嚴(yán)重且均勻，感病對(duì)照‘蘋果梨’的發(fā)病率分別達(dá)到96%和93%，感病指數(shù)分別達(dá)到63.78和 62.78，平均感病指數(shù)為63.28±0.71?！缢掷妗痢S冠梨’雜交F1代實(shí)生樹215株，白粉病發(fā)病率達(dá)到100%，感病指數(shù)最低為0.14±0.20，最高為 77.71±8.08，平均為23.59±3.03，抗病植株數(shù)量最多，為71株，占33.02%，其次為高抗植株62株，占28.84%，高感植株有38株，占 17.67%；‘錦豐梨’ב黃冠梨’雜交F1代實(shí)生樹362株，白粉病發(fā)病率為98.34%，感病指數(shù)最低為0，最高為62.43±12.32，平均為15.17± 4.71，高抗植株數(shù)量最多，為151株，占41.71%，其次為抗病植株112株，占30.94%，高感植株有20株，占 5.52%，還存在6株不感病植株(表1，表2)。‘早酥梨’ב黃冠梨’雜交F1代群體中，不感病、高抗和抗病植株比例為61.86%，而‘錦豐梨’ב黃冠梨’雜交F1代群體中，不感病、高抗和抗病植株比例達(dá)到74.31%；說明‘黃冠梨’的抗白粉病特性對(duì)F1代的影響較大(表2)。

2.3 雜交F1代白粉病抗性遺傳傾向分析

‘早酥梨’兩年平均感病指數(shù)為58.44± 2.83，對(duì)白粉病高感，‘黃冠梨’兩年平均感病指數(shù)為 20.50±1.33，抗白粉病，‘早酥梨’ב黃冠梨’雜交F1代群體感病指數(shù)均值為23.59±3.03，低于中親值，遺傳傳遞力為59.78%，變異系數(shù)為 92.31%，F(xiàn)1代分離廣泛，F(xiàn)1代低于低親值的實(shí)生樹118株，占54.88%(表3)?！\豐梨’兩年平均感病指數(shù)為33.23±3.30，感白粉病，‘錦豐梨’ב黃冠梨’雜交F1代群體感病指數(shù)均值為 15.17±4.71，低于中親值，甚至低于低親值，低低親植株有257株，占70.99%，表現(xiàn)出低低親遺傳傾向，遺傳傳遞力為56.46%，變異系數(shù)達(dá)到 111.16%，后代分離極其廣泛(表4)。兩個(gè)‘黃冠梨’雜交組合的F1代群體均表現(xiàn)出低親遺傳傾向，即傾向于‘黃冠梨’的抗病遺傳。

A.感染梨樹白粉病的葉片 The leaf symptoms of pear powdery mildew；B、C.梨樹白粉病菌的子囊果 The ascocarp of pear powdery mildew pathogen；D.梨樹白粉病菌的子囊 The asci of pear powdery mildew pathogen

圖1 梨樹白粉病葉片癥狀和病菌特征Fig.1 Leaf symptoms and pathogen characteristics of pear powdery mildew

表2 兩個(gè)‘黃冠梨’雜交組合后代對(duì)白粉病不同抗病程度植株的數(shù)量Table 2 The number of different resistance plant to pear powdery mildew in two ‘Huangguanli’ hybridized combinations

表3 ‘早酥梨’ב黃冠梨’雜交組合后代對(duì)白粉病抗性的遺傳變異Table 3 The hereditary variation on the resistance to pear powdery mildew of ‘Zaosuli’בHuangguanli’ hybridized combinations

表4 ‘錦豐梨’ב黃冠梨’雜交組合后代對(duì)白粉病抗性的遺傳變異Table 4 The hereditary variation on the resistance to pear powdery mildew of ‘Jinfengli’בHuangguanli’ hybridized combinations

3 討論與結(jié)論

梨樹白粉病病原菌白叉絲單囊殼(P.leucotricha)也是蘋果白粉病病原菌[13]，研究表明蘋果白粉病抗性屬于多基因控制的數(shù)量性狀遺傳[14]，目前，源于Malusrobusta的Pl1[15]和源于M.zumi中的Pl2[16]是應(yīng)用于蘋果抗白粉病育種的主要基因，對(duì)蘋果白粉病抗性基因的QTL作圖也在研究中[13,17]。但當(dāng)前國內(nèi)外缺乏梨樹抗白粉病基因篩選和QTL定位的相關(guān)研究，在梨樹抗白粉病種質(zhì)資源檢測(cè)方面，Serdani等[18]檢測(cè)了31個(gè)亞洲梨栽培種和122個(gè)歐洲梨栽培種對(duì)白叉絲單囊殼(P.leucotricha)的抗性，發(fā)現(xiàn)在溫室中，95%的歐洲梨和38%的亞洲梨易感染白粉病，在田間，42%的歐洲梨和23%的亞洲梨易被白叉絲單囊殼(P.leucotricha)感染。歐洲梨白粉病病原菌以白叉絲單囊殼(P.leucotricha)為主，但是目前中國梨樹白粉病病原菌報(bào)道較多的是梨球針殼(P.pyri)[8]，且近幾年梨樹白粉病有加重的趨勢(shì)，因此對(duì)中國梨樹種質(zhì)抗白粉病特性以及梨樹抗白粉病基因QTL定位的研究亟待進(jìn)行。筆者田間調(diào)查和鑒定發(fā)現(xiàn)，調(diào)查地區(qū)梨樹白粉病病原菌為梨球針殼(P.pyri)，未發(fā)現(xiàn)其他白粉病菌，而且‘黃冠梨’對(duì)白粉病表現(xiàn)抗病，‘早酥梨’表現(xiàn)高感，‘錦豐梨’表現(xiàn)為感病，因此，選擇‘早酥梨’ב黃冠梨’和‘錦豐梨’ב黃冠梨’兩個(gè)雜交組合F1代作為研究對(duì)象。目前，沒有梨樹白粉病病害分級(jí)的相關(guān)報(bào)道，由于梨樹與蘋果樹高度同源，本研究參照蘋果白粉病病害分級(jí)方法進(jìn)行梨樹白粉病的分級(jí)和抗病程度的分級(jí)。通過對(duì)‘黃冠梨’兩個(gè)雜交組合F1代白粉病的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)‘早酥梨’ב黃冠梨’和‘錦豐梨’ב黃冠梨’兩個(gè)雜交組合F1代白粉病發(fā)病率分別達(dá)到100%和98.34%，白粉病感病指數(shù)最高達(dá)到77.71± 8.08，遺傳變異分析顯示，黃冠梨兩個(gè)雜交組合F1代群體均具有低親遺傳傾向，即具有抗病遺傳傾向，且在兩個(gè)雜交組合F1代中，高抗和抗病植株比例均較高，從中篩選到抗白粉病品種的概率較高。本研究結(jié)果為進(jìn)一步分離鑒定梨白粉病抗病基因，構(gòu)建白粉病抗病基因QTL定位圖譜奠定了基礎(chǔ)。