8倍稀釋血清可有效評估種雞群沙門氏菌的感染

郭龍宗 李玉燕 丁愛君 崔治中

摘? 要：本試驗對孵化毛蛋中持續(xù)分離到沙門氏菌和間斷性分離到沙門氏菌的場區(qū)，分別采集種雞群血清進行沙門氏菌平板凝集試驗，將血清樣品分為4組：未稀釋血清陽性、血清2倍稀釋后陽性、血清4倍稀釋后陽性和血清8倍稀釋后陽性，將這4組血清分別用ELISA B+D群沙門氏菌菌屬抗體檢測試劑盒進行復(fù)核檢測。結(jié)果顯示：這兩個場區(qū)將血清8倍稀釋后平板凝集試驗結(jié)果和ELISA的檢測結(jié)果最接近，陽性吻合率分別為97.9%和98.8%。結(jié)果顯示：將檢雞群血清8倍稀釋后進行沙門氏菌平板凝集試驗和ELISA B+D群沙門氏菌菌屬抗體檢測方法具有較高的相關(guān)性，可有效評估臨床沙門氏菌的野毒感染。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;血清8倍稀釋;平板凝集

中圖分類號：S858.312.5? ? ?文獻標(biāo)識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）09-0006-07

禽沙門氏菌病是由多種沙門氏菌引起的禽類疾病的總稱，根據(jù)病原體的特征分為三種疾病：雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒。沙門氏菌普遍存在于集約化雞場，是最重要的卵傳細(xì)菌性傳染病之一[1]。沙門氏菌感染可引起禽類各種急性和慢性疾病，可造成重大的經(jīng)濟損失，各國家在檢測和控制該病投入了大量資金[2]。沙門氏菌病是具有重要意義的人畜共患病之一[3]，對醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生學(xué)均具有十分重要的意義。

目前集約化雞場臨床檢測沙門氏菌的檢測方法主要包括血清學(xué)試驗、細(xì)菌學(xué)分離實驗以及分子生物學(xué)檢測方法。血清學(xué)實驗常用于臨床篩檢大規(guī)模血清樣本，主要包括血清平板凝集試驗和ELISA試驗。申之義[4]等采用平板凝集試驗對內(nèi)蒙古地區(qū)雞沙門氏菌病流行病學(xué)進行了調(diào)查。沙門氏菌ELISA方法靈敏度高，同樣適用于大批樣本檢測[5]。本研究采用血清平板凝集試驗對膠東地區(qū)2012～2015年的42批祖代肉種雞、26批父母代肉種雞和2011～2015年23批祖代蛋雞用雞白痢-傷寒平板凝集試驗進行血清學(xué)跟蹤調(diào)查;同時論證了陽性血清8倍稀釋后沙門氏菌平板凝集試驗與ELISA檢測和沙門氏菌病原分離的相關(guān)性。匯總統(tǒng)計各批次每周種雞群未稀釋血清和血清8倍稀釋后平板凝集試驗檢測的陽性率，按照雞群年度批次進行統(tǒng)計分析，用于評估沙門氏菌各項措施的控制效果。

1? 材料與方法

1.1? 試劑? B群和D群沙門氏菌屬抗體檢測試劑盒，購自BioChek公司;雞白痢雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原，購自北京中海生物科技有限公司。

1.2? 樣品的采集與處理? 選取膠東地區(qū)2012～2015年的42批祖代肉種雞、26批父母代肉種雞和2011～2015年23批祖代蛋雞用雞白痢-傷寒平板凝集試驗進行血清學(xué)跟蹤調(diào)查，分別在16、19、21、24、26、28、30、32、34、36、39、42、46、48、50、52、55、58、61、65周采集血清進行平板凝集試驗，每場采集的血清量為雞群飼養(yǎng)量的1%，對平板凝集陽性的血清用生理鹽水做8倍稀釋，后再用雞白痢-傷寒平板凝集試驗進行復(fù)檢，計算統(tǒng)計每周的陽性率和血清8倍稀釋后檢測的陽性率，并按照雞群年度批次進行統(tǒng)計分析，用于評估各項措施的控制效果。

1.3? 沙門氏菌平板凝集試驗方法? 分別吸取30 μL的陽性血清、陰性血清和待檢血清，滴于清潔玻璃板上，隨后滴加同量的凝集試驗抗原，用槍頭彎折面使血清與抗原均勻混合，涂布成直徑為1～2cm的液面，不斷輕輕搖動玻璃板，2min后即可觀察結(jié)果。

1.4? 用ELISA方法測定血清中沙門氏菌B+D群菌屬抗體的試驗方法? 對連續(xù)4個月在種雞和種蛋孵化啄殼死亡毛蛋中持續(xù)分離到沙門氏菌的3個對應(yīng)種雞群采集血清，進行沙門氏菌平板凝集試驗，將血清樣品分為4組：未稀釋血清平板凝集試驗陽性、血清2倍稀釋后陽性、血清4倍稀釋后陽性和血清8倍稀釋后陽性，將4組血清分別用ELISA B+D群沙門氏菌菌屬抗體檢測試劑盒進行檢測。同樣采集在4個月中間斷性在孵化毛蛋中分離到沙門氏菌的雞場種雞血清，一共3個種雞場，按照同樣方法對血清進行稀釋，對不同稀釋度的陽性血清用BIOCHEK沙門氏菌B+D群菌屬ELISA抗體試劑盒進行檢測，檢測方法參照ELISA試劑盒操作說明進行。

采集5個沙門氏菌分離陰性場的血清進行雞白痢-傷寒平板凝集試驗檢測，對317份凝集試驗陽性的血清用ELISA方法進行復(fù)核檢測。同時選取一個肉種雞病原學(xué)陽性場（父18場）和一個病原學(xué)陰性場（父17場），采集血清進行雞白痢-傷寒平板凝集試驗檢測，并對陽性血清8倍稀釋后再用平板凝集試驗進行復(fù)檢，匯總分析試驗結(jié)果。

2? 結(jié)果

2.1? 2012～2015年度不同種雞群的平板凝集試驗和8倍稀釋平板凝集試驗結(jié)果分析? 采集膠東地區(qū)2012～2015年的42個祖代肉種雞批次、26批父母代肉種雞和2011～2015年23個祖代蛋雞批次的血清，用雞白痢-傷寒平板凝集試驗進行檢測，合計檢測血清 330660份。其中，42批祖代肉種雞在不同周齡的平均平板凝集陽性率，在19周時陽性率最高，達21.3%;在58周陽性率最低，為10.3%，見圖1;從年度比較可以發(fā)現(xiàn)，2012年度整體趨勢最高，2014年度雞群在30周之前較低，32周之后與2013年呈交叉趨勢，2015年度雞群平板凝集陽性率最低，30周之后的產(chǎn)蛋期的陽性率都在15%以下，只有在產(chǎn)蛋最后期的65周上升至18.8%，見圖2。

將各年度各批次的血清8倍稀釋后平板凝集試驗陽性率結(jié)果顯示：2013～2015年度批次的下降是明顯的（2012年度未采用血清稀釋的方法，缺少該年度數(shù)據(jù)），特別是2015年度批次30～52周齡陽性率為0%，但55周后有上升趨勢，見圖3。

父母代場血清8倍稀釋后的平板凝集陽性率2015年與2013～2014年度雞群相比，下降明顯，見圖4;特別是2013～2014年度祖代肉種雞群46周血清稀釋陽性率要高于2%，而2015年的陽性率則低于1%。

23批祖代蛋種雞未稀釋血清平均平板凝集陽性率在19周最高，高達7.52%，這一周齡與肉種雞相同，其他周齡的陽性率均低于8%，見圖5。整個飼養(yǎng)周期的陽性率對比：蛋種雞明顯低于肉種雞，肉種雞陽性率普遍在10%～20%之間，見圖1、圖5。不同年度雞群平均未稀釋血清平板凝集陽性率的比較：2015年度批次陽性率最低，均低于 3.5%，并且多個周齡連續(xù)監(jiān)測為陰性，見圖6，因蛋種雞前期未使用血清稀釋的方法檢測，同時后期稀釋后極少出現(xiàn)陽性，故未采用血清稀釋的方法進行比較。

2.2? 8倍稀釋平板凝集陽性血清與ELISA檢測、臨床相關(guān)性? 對孵化毛蛋中持續(xù)分離到沙門氏菌和間斷性分離到沙門氏菌的三個場區(qū)，分別采集種雞群血清進行沙門氏菌平板凝集試驗，對結(jié)果陽性的血清進行2倍稀釋、4倍稀釋、8倍稀釋后同時用雞白痢-傷寒平板凝集試驗和ELISA B+D群沙門氏菌菌屬抗體檢測試劑盒進行檢測。試驗結(jié)果的相關(guān)性比較分析見表1、表2。在孵化毛蛋中持續(xù)分離到沙門氏菌的場區(qū)，將陽性血清8倍稀釋后平板凝集試驗仍呈陽性的結(jié)果和ELISA的檢測結(jié)果最接近，陽性吻合率達97.9%;在毛蛋中間斷性分離到沙門氏菌的場區(qū)，將陽性血清8倍稀釋后平板凝集試驗仍呈陽性的結(jié)果和ELISA檢測陽性吻合率可達98.8%。結(jié)果顯示這兩種方法具有較高的相關(guān)性，而未稀釋血清和2倍稀釋血清的平板凝集試驗結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果差距明顯。其中血清未稀釋組持續(xù)分離到病原場的血清吻合率為62.5%，而間斷性分離場的則為7.7%。

采集5個沙門氏菌分離陰性場未稀釋的血清進行雞白痢-傷寒平板凝集試驗檢測，對317份凝集試驗陽性的血清用ELISA方法進行復(fù)核檢測，結(jié)果只有1份陽性。這說明未稀釋血清的平板凝集試驗假陽性率非常高。同時選取一個肉種雞病原學(xué)陽性場（父18場）和一個病原學(xué)陰性場（父17場），采集血清進行雞白痢-傷寒平板凝集試驗檢測，并對陽性血清8倍稀釋后再用平板凝集試驗進行復(fù)檢，結(jié)果顯示：這兩個場未稀釋血清的平板凝集試驗結(jié)果的陽性率有差異，見圖7。

從圖7可知，父母代18場陽性率持續(xù)高于父母代17場，但同時陰性場（父17）未稀釋血清也存在持續(xù)的平板凝集陽性結(jié)果;而將血清8倍稀釋后進行沙門氏菌平板凝集試驗，僅在父母代18場檢測結(jié)果陽性，而陰性場（父17）平板凝集試驗檢測均為陰性，符合沙門氏菌感染的真實狀態(tài)。這也證明：將血清8倍稀釋后進行雞白痢-傷寒平板凝集試驗更有利于排除假陽性的干擾，可有效評估雞群是否受到沙門氏菌野毒感染，便于養(yǎng)殖場采取對應(yīng)的防控措施。

3? 討論

3.1? 種雞群平板凝集陽性率對雞群凈化的評估

對不同年度種雞群未稀釋血清連續(xù)雞白痢-傷寒平板凝集檢測發(fā)現(xiàn)，平板凝集陽性率呈逐漸下降趨勢，但在2015年度沙門氏菌分離為陰性的祖代肉、蛋種雞群，未稀釋血清平板凝集檢測仍存在一定的陽性率。整個產(chǎn)蛋周期內(nèi)連續(xù)對未稀釋血清平板凝集陽性的雞只進行沙門氏菌病原分離，并未分離到沙門氏菌，但平板凝集試驗卻呈現(xiàn)波動的陽性，這說明未稀釋血清平板凝集試驗存在假陽性。假陽性率的高度變化，蛋雞、肉種雞檢測的結(jié)果并不一致，肉種雞要高于蛋種雞，說明平板凝集陽性率存在多種因素的干擾。許多細(xì)菌與雞白痢沙門氏菌具有共同抗原或抗原性極為密切，這些細(xì)菌可感染禽類，并產(chǎn)生凝集素應(yīng)答。已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、微球菌和鏈球菌（尤其是蘭氏D群的鏈球菌）感染構(gòu)成了雞的非白痢陽性反應(yīng)的大部分。其他細(xì)菌所致的感染如表皮葡萄球菌、微球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、大腸桿菌及某些種的亞利桑那菌、普羅維登氏菌和枸櫞酸菌，與許多非白痢陽性反應(yīng)有關(guān)。其他沙門氏菌特別是D群的細(xì)菌如腸炎沙門氏菌，同樣可產(chǎn)生交叉反應(yīng)，禽群中非白痢陽性者可從少數(shù)幾只到30%～40%的數(shù)量，凝集反應(yīng)特性變化不一[1]。我們檢測到的平板凝集試驗陽性菌就是腸炎沙門氏菌引起的平板凝集陽性，而非白痢。在平板凝集陽性雞只我們分離到過類弗氏檸檬桿菌，其培養(yǎng)和單因子凝集結(jié)果接近沙門氏菌，是造成假陽性的原因之一。對有代表性的陽性反應(yīng)雞只進行一系列的細(xì)菌學(xué)檢查，通常才是確定雞群是否感染沙門氏菌以及感染哪種沙門氏菌。通過病原陰性場平板凝集陽性率的曲線發(fā)現(xiàn)，平板凝集陽性率與油苗的免疫有一定的關(guān)聯(lián)性，特別鼻炎和支原體等油苗的免疫更會刺激產(chǎn)生假陽性;血清凍融、血脂含量、反應(yīng)溫度、不同人的主觀判定都會影響平板凝集試驗結(jié)果。

3.2? 血清8倍稀釋方法對雞群感染狀況的評估可行性? 因?qū)嶋H生產(chǎn)中雞群免疫、其他細(xì)菌感染等復(fù)雜的環(huán)境，雞群雞白痢-傷寒平板凝集試驗受到多重因素的干擾，容易出現(xiàn)假陽性的問題。細(xì)菌分離在某些企業(yè)還未開展，大多數(shù)養(yǎng)殖場實驗室都能熟練操作ELISA方法，但其檢測費用太高，不適合臨床雞群的日常監(jiān)控與凈化。生產(chǎn)中高代次雞群的重點是凈化，而低代次解決的是判定感染狀況與降低對生產(chǎn)的影響為最終目的。因此，我們采用了血清8倍稀釋后進行平板凝集的方法，并用ELISA B+D群沙門氏菌屬檢測試劑盒進行復(fù)核，發(fā)現(xiàn)血清8倍稀釋后陽性與ELISA檢測數(shù)據(jù)之間具有較強的對應(yīng)性;其次也發(fā)現(xiàn)若雞群雞白痢-傷寒平板凝集試驗陽性率快速上升，同時血清8倍稀釋后檢測仍為陽性時，臨床產(chǎn)蛋孵化雛雞的投訴率也會有快速上升的趨勢。因此，血清8倍稀釋后雞白痢-傷寒沙門氏菌平板凝集陽性率可有效評估臨床沙門氏菌野毒感染的狀態(tài)，并為沙門氏菌的臨床用藥和凈化控制奠定基礎(chǔ)。

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Wild Virus Infection of Clinical Salmonella can be effectively evaluated by Salmonella plate agglutination test after 8-fold dilution of chicken serum

GUO Longzong1， LI Yuyan1 ，DING Aijun1 ，Cui Zhizhong2*

（1.Shandong Yisheng Animal and Poultry Breeding Company，Yantai 264680，China;

2.Shandong Agricultural University，Taian 271000，China）

Abstract：Salmonella was continuously isolated from hatched eggs and intermittently isolated to Salmonella fields.Serum samples of chicken flocks were collected for Salmonella plate agglutination test. Serum samples were divided into four groups：undiluted serum positive，serum positive after 2 times dilution，serum positive after 4 times dilution and serum positive after 8 times dilution.The four groups of sera were detected by ELISA B + D group Salmonella antibody detection kit.The results of plate agglutination test after 8 times dilution of serum were the closest to result of ELISA.The positive coincidence rates were 97.9% and 98.8% respectively.The results showed that Salmonella plate agglutination test and ELISA B + D group Salmonella antibody detection method had high correlation after 8 times dilution of chicken serum，which could effectively evaluate clinical Salmonella wild virus infection.

Key Words：Salmonella; Serum 8-fold dilution; Plate agglutination; ELISA□