氨基酸手性熒光識(shí)別及光學(xué)組成測(cè)定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

朱園園，王子君，古雙喜，張 珩

氨基酸手性熒光識(shí)別及光學(xué)組成測(cè)定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

朱園園1，王子君1，古雙喜2，張 珩2

（1. 武漢工程大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205； 2. 武漢工程大學(xué) 化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205）

將前沿的科研成果轉(zhuǎn)化成綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，設(shè)計(jì)了熒光探針對(duì)氨基酸手性識(shí)別及光學(xué)組成測(cè)定的綜合性實(shí)驗(yàn)。闡述了熒光探針的手性識(shí)別原理、實(shí)驗(yàn)流程、實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。該實(shí)驗(yàn)屬于手性化學(xué)、光物理、光化學(xué)、分析化學(xué)交叉學(xué)科的前沿研究領(lǐng)域，能激發(fā)學(xué)生的科研興趣，培養(yǎng)學(xué)生的綜合科研能力。該實(shí)驗(yàn)還具有可拓展性，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)綜合實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和單一性問題。

綜合實(shí)驗(yàn)；熒光探針；手性識(shí)別

在當(dāng)今科技高度發(fā)展的時(shí)代，化學(xué)正從傳統(tǒng)的化學(xué)化工領(lǐng)域向能源、生命、材料、信息、醫(yī)藥等領(lǐng)域滲透[1]。這就要求化學(xué)專業(yè)應(yīng)以培養(yǎng)知識(shí)面廣、綜合素質(zhì)高、有創(chuàng)新能力，且對(duì)交叉學(xué)科和前沿研究領(lǐng)域具有一定敏感性的高級(jí)專業(yè)人才為目標(biāo)。而化學(xué)是一門建立在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的學(xué)科，教學(xué)實(shí)驗(yàn)的合理設(shè)計(jì)對(duì)人才的培養(yǎng)至關(guān)重要[2-5]。我校的化學(xué)專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)是在學(xué)生完成4大化學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開設(shè)的，目的是加強(qiáng)學(xué)生綜合分析問題和解決問題的能力。本文 提出“熒光探針對(duì)氨基酸的手性識(shí)別及光學(xué)組成的測(cè)定”實(shí)驗(yàn)，是具有代表性的綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)例。

1 實(shí)驗(yàn)概述

手性是自然界的基本屬性。作為生命活動(dòng)基礎(chǔ)的大分子及生命過程中發(fā)生的各種生物、化學(xué)反應(yīng)均與手性密切相關(guān)。其中手性氨基酸是生命的重要組成部分，并且顯示出重要的生物學(xué)功能。目前，手性藥物在上市藥物中的比重越來越大，而手性藥物的不對(duì)稱合成中，手性氨基酸常被用作手性前體和手性催化劑配體。因此，氨基酸的手性識(shí)別引起了大量關(guān)注。

近20年來，熒光探針由于其測(cè)定快速、操作簡(jiǎn)單并可批量測(cè)定的優(yōu)勢(shì)，在有機(jī)化合物手性識(shí)別中的應(yīng)用取得很大進(jìn)展[6-9]。2014年，由Pu和Yu研究組合作在中報(bào)道了Zn(II)可以顯著提高基于手性醛的分子熒光探針()-1（見圖1）對(duì)手性氨類的對(duì)映選擇性識(shí)別[10]，后續(xù)又有關(guān)于不同結(jié)構(gòu)的手性醛類熒光探針在Zn(II)存在條件下對(duì)手性氨類（包括氨基酸）的對(duì)映選擇性識(shí)別的報(bào)道[11-13]。

圖1 熒光探針分子結(jié)構(gòu)式

2019年，我們研究組與Pu研究組合作設(shè)計(jì)的一類熒光探針，將該類型的探針對(duì)氨基酸的對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)比ef提高到了199[14]。ef=[L–0]/[D–0]=L/D，其中，0為探針分子的熒光強(qiáng)度，L和D分別為與L和D構(gòu)型的底物反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度。將此課題研究中較為成熟的內(nèi)容提煉出來，作為化學(xué)專業(yè)的綜合實(shí)驗(yàn)“熒光探針對(duì)氨基酸的手性識(shí)別及光學(xué)組成測(cè)定”。

2 實(shí)驗(yàn)原理

探針分子()-1在氨基酸存在時(shí)，其醛基與氨基酸的氨基可以進(jìn)行縮合反應(yīng)生成亞胺。由于—C==N—與其鄰位—OH存在氫鍵作用可以形成OH···N==C，從而使其在激發(fā)狀態(tài)下存在分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，使得熒光淬滅。但當(dāng)與Zn2+絡(luò)合時(shí)，這種激發(fā)態(tài)的分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移會(huì)被抑制，從而使熒光增強(qiáng)[10]。當(dāng)()-1與不同構(gòu)型的氨基酸作用時(shí)，由于空間位阻及亞胺產(chǎn)物的分子剛性和穩(wěn)定性的差別，熒光增強(qiáng)程度不同，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸的手性識(shí)別。另外，若能找到探針熒光強(qiáng)度與氨基酸光學(xué)組成之間的關(guān)系，便能同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸光學(xué)組成的測(cè)定。

3 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

儀器：Horiba FluoroMax-4熒光分光光度計(jì)，電子天平，微量移液槍，移液管，4 mL帶刻度離心管。

藥品：熒光探針()-1（99%，自制），D-苯丙氨酸（D-Phe，99%，Macklin），L-苯丙氨酸（L-Phe，99%，Macklin），四丁基氫氧化銨（TBAH·30H2O，98%，Aladdin），無水醋酸鋅（99.99%，Macklin），乙腈（HPLC級(jí)），去離子水（自制）。

4 實(shí)驗(yàn)基本流程及實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)基本流程如圖2所示，包括熒光探針分子和氨基酸母液的配置，探針分子與氨基酸反應(yīng)液的制備及熒光的測(cè)定等。

圖2 實(shí)驗(yàn)流程圖

4.1 母液的配置

4 mg ()-1溶于5.8 mL CH3CN得到2 mM熒光探針母液；256 mg TBAH·30H2O溶于10 mL去離子水得到32 mmol/L的TBAH水溶液；分別稱取5.3 mg D-Phe和L-Phe溶于32 mmol/L的TBAH水溶液得到32 mmol/L的氨基酸母液；5.9 mg Zn(OAc)2溶于5 mL去離子水得到6.4 mmol/L的Zn(OAc)2水溶液。

4.2 反應(yīng)液的制備

2 mmol/L熒光探針母液用CH3CN稀釋至0.2 mmol/L備用；將32 mmol/L的D-Phe和L-Phe氨基酸母液分別用32 mmol/L的TBAH水溶液稀釋至25.6、19.2、12.8、9.6、6.4、3.2 mmol/L的氨基酸水溶液備用。

接下來進(jìn)行氨基酸手性識(shí)別以及熒光強(qiáng)度與氨基酸當(dāng)量關(guān)系測(cè)定的反應(yīng)液制備。

用移液槍分別移取14份400 μL的()-1熒光探針母液（0.2 mmol/L，1 equiv）于4 mL帶刻度離心管中；再用移液槍分別移取25 μL濃度為3.2、6.4、9.6、12.8、19.2、25.6、32 mmol/L的D-Phe溶液（1、2、3、4、6、8、10 equiv）依次加入7份400 μL的()-1溶液中，同樣用移液槍分別移取25 μL濃度為3.2、6.4、9.6、12.8、19.2、25.6、32 mmol/L的L-Phe溶液（1、2、3、4、6、8、10 equiv）依次加入另外7份400 μL的()-1溶液中；最后用移液槍移取14份25 μL的Zn(OAc)2水溶液（6.4 mM，2 equiv）分別加入以上14份()-1和氨基酸的混合液中。

所有反應(yīng)液于離心管中密閉靜置2 h后加CH3CN稀釋至4 mL得到熒光待測(cè)液，此待測(cè)液中()-1的濃度為0.02 mmol/L。同時(shí)，濃度為0.02 mmol/L純的()-1探針乙腈溶液，加入了2 equiv Zn(OAc)2的探針溶液，以及同時(shí)加入了2 equiv Zn(OAc)2和10 equiv TBAH的探針溶液分別作為熒光識(shí)別的對(duì)照溶液。

最后進(jìn)行熒光強(qiáng)度與氨基酸光學(xué)純度關(guān)系測(cè)定的反應(yīng)液制備。

將濃度為12.8 mmol/L的D-Phe和L-Phe的溶液以不同體積比混合，分別得到總體積為200 μL，L-Phe的光學(xué)純度ee值（ee=([L]–[D])/([L]+[D])）分別為–100%、–80%、–60%、–40%、–20%、0、20%、40%、60%、80%、100%的氨基酸溶液備用。用移液槍移取11份400 μL的()-1熒光探針母液（0.2 mmol/L，1 equiv）于4 mL帶刻度離心管中，再用移液槍移取25 μL如上配置的ee值為–100%~100%的11份氨基酸溶液分別加入離心管中，最后用移液槍移取25 μL的Zn(OAc)2水溶液（6.4 mmol/L, 2 equiv）加入這11份混合液中。所有反應(yīng)液于離心管中密閉靜置2 h后，加CH3CN稀釋至4 mL，得到熒光待測(cè)液，此待測(cè)液中()-1的濃度為0.02 mmol/L。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

5.1 激發(fā)波長(zhǎng)的選擇

為了選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)，應(yīng)用熒光儀的3D模式，并設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描范圍分別為317 ~ 417 nm和335~850 nm，對(duì)()-1 + 14 equiv L-Phe (in TBAH) + 2 equiv Zn(II)的混合反應(yīng)液進(jìn)行了測(cè)試，得到如圖3所示的激發(fā)波長(zhǎng)EX、發(fā)射波長(zhǎng)EM、熒光強(qiáng)度的關(guān)系圖。從圖3可以看到，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)在400~420 nm范圍內(nèi)時(shí)，位于510 nm左右的發(fā)射峰強(qiáng)度最強(qiáng)。因此在后面的熒光測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，選擇了處于該范圍內(nèi)的417 nm為激發(fā)波長(zhǎng)。

進(jìn)行圖3測(cè)試的反應(yīng)液為0.2 mmol/L ()-1（400 μL，in CH3CN，1 equiv）、12.8 mmol/L L-Phe（25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，4 equiv）和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液（25 μL，2 equiv）的混合液；反應(yīng)液在室溫靜置2 h，并用乙腈稀釋至4 mL后再進(jìn)行熒光測(cè)試；EX= 317 ~ 517 nm，EM= 335 ~ 850 nm，Slit = 2/2 nm。

圖3 激發(fā)波長(zhǎng)-發(fā)射波長(zhǎng)-熒光強(qiáng)度關(guān)系圖

5.2 探針熒光強(qiáng)度與氨基酸當(dāng)量的關(guān)系及其對(duì)氨基酸的手性選擇性

在所選擇的激發(fā)波長(zhǎng)下，研究了在2 equiv Zn(II)存在條件下，該熒光探針對(duì)不同構(gòu)型的Phe在不同當(dāng)量下的熒光響應(yīng)情況，如圖4(a)和4(b)所示。可以看到，未加入氨基酸的sensor、sensor + Zn(II)以及sensor + Zn(II) + TBAH體系均沒有熒光，雖然L和D構(gòu)型Phe的加入均能打開該探針在＞500 nm的熒光窗口，但是該探針對(duì)L-Phe的熒光響應(yīng)明顯強(qiáng)于對(duì)D-Phe的響應(yīng)。圖4(c)顯示了510 nm處的熒光強(qiáng)度與不同構(gòu)型的Phe的當(dāng)量之間的關(guān)系，當(dāng)該探針體系中加入L構(gòu)型的Phe時(shí)，在1 ~ 4 equiv范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨氨基酸當(dāng)量的增加而顯著增加，在4 equiv L-Phe的條件下達(dá)到最大，繼續(xù)增加L-Phe的量反而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。這說明4 equiv L-Phe與()-1和Zn(II)反應(yīng)可以達(dá)到平衡，繼續(xù)增加氨基酸的濃度會(huì)導(dǎo)致體系熒光的淬滅。而當(dāng)該探針體系加入D構(gòu)型的Phe時(shí)，雖然熒光強(qiáng)度與氨基酸當(dāng)量之間的關(guān)系與加入L-Phe的體系類似，但是在整個(gè)1~10 equiv范圍內(nèi)，熒光響應(yīng)都明顯弱于L構(gòu)型。因此，()-1可以作為Phe手性識(shí)別的熒光探針。圖4(d)顯示了該探針體系對(duì)4 equiv D和L構(gòu)型的Phe的對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)結(jié)果，計(jì)算得到選擇性熒光增強(qiáng)比為3.6。

圖4 熒光探針在不同條件下的熒光響應(yīng)

圖4(a)為0.2 mmol/L ()-1(400 μL，in CH3CN，1 equiv、3.2~32 mmol/L L-Phe(25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，1~10 equiv)和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液(25 μL，2 equiv)混合液的熒光光譜；圖4(b)為0.2 mmol/L ()-1(400 μL，in CH3CN，1 equiv、3.2~ 32 mmol/L D-Phe(25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，1~10 equiv)和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液（25 μL，2 equiv）混合液的熒光光譜；圖4(c)為熒光探針在510 nm的熒光強(qiáng)度隨D-/L-Phe當(dāng)量的變化；圖4(d)為熒光探針對(duì)4 equiv D-Phe和L-Phe的熒光響應(yīng)。所有反應(yīng)液均在室溫密閉靜置2 h后用乙腈稀釋至4 mL，再進(jìn)行熒光測(cè)試；EX= 417 nm，Slit = 2/2 nm。

5.3 測(cè)定氨基酸光學(xué)組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

為了實(shí)現(xiàn)該熒光探針在氨基酸光學(xué)組成測(cè)定中的應(yīng)用，通過測(cè)試得到了熒光強(qiáng)度與氨基酸光學(xué)組成之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在4 equiv的Phe的條件下，得到了如圖5所示的關(guān)系圖。結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度與L-Phe的值呈線性關(guān)系，直線方程為= 5 349.62 + 1.10 × 10–6, 確定系數(shù)R-Square為0.977 69，其中為510 nm處的熒光強(qiáng)度，為L(zhǎng)-Phe的光學(xué)純度ee值。該結(jié)果說明熒光探針()-1可以用來進(jìn)行氨基酸光學(xué)組成的測(cè)定。

圖5 熒光強(qiáng)度與氨基酸光學(xué)組成之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線

熒光探針在510 nm的熒光強(qiáng)度與L-Phe光學(xué)純度ee之間的關(guān)系測(cè)試中，測(cè)試液為0.2 mmol/L ()-1（400 μL，in CH3CN，1 equiv）、不同光學(xué)純度12.8 mmol/L Phe（25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，4 equiv）和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液（25 μL，2 equiv）的混合液，在室溫下密閉靜置2 h后用乙腈稀釋至4 mL，再進(jìn)行熒光測(cè)試。EX= 417 nm，Slit = 2/2 nm。

6 結(jié)語

該實(shí)驗(yàn)綜合了手性化學(xué)、光物理、光化學(xué)、分析化學(xué)的內(nèi)容，屬于交叉學(xué)科的前沿性綜合實(shí)驗(yàn)，本文從實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程、具體操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析等方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析中，按“激發(fā)波長(zhǎng)選擇—氨基酸手性熒光識(shí)別—氨基酸光學(xué)組成測(cè)定”的思路來進(jìn)行討論，使學(xué)生對(duì)熒光探針的研究方法有一個(gè)全方位的認(rèn)識(shí)，豐富了學(xué)生的研究思路。該實(shí)驗(yàn)還可拓展到對(duì)其他氨基酸或其他手性氨類的熒光識(shí)別上，可以讓不同學(xué)生做不同的手性底物，激發(fā)研究興趣，開拓研究思維，彌補(bǔ)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、單一性問題。另外，針對(duì)部分綜合能力較強(qiáng)的學(xué)生，可以將該實(shí)驗(yàn)拓展至通過核磁和質(zhì)譜等表征手段對(duì)手性識(shí)別機(jī)理進(jìn)行研究。

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Design on experiment of chiral fluorescence recognition and optical composition determination of amino acids

ZHU Yuanyuan1, WANG Zijun1, GU Shuangxi2, ZHANG Heng2

(1. School of Chemistry and Environmental Engineering, Wuhan Institute of Technology, Wuhan 430205, China; 2. School of Chemical Engineering and Pharmacy, Wuhan Institute of Technology, Wuhan 430205, China)

The frontier scientific research results are transformed into comprehensive experimental teaching contents. A comprehensive experiment of chiral recognition and optical composition determination of amino acids by fluorescent probes is designed. The principle of chiral recognition of fluorescent probes, the experimental process, the experimental operation and the analysis of experimental results are described. This experiment belongs to the frontier research field of chiral chemistry, photophysics, photochemistry and analytical chemistry, which can stimulate students’ interest in scientific research and cultivate their comprehensive scientific research ability. This experiment also has expansibility, which can make up for the repeatability and singularity of traditional comprehensive experiment.

comprehensive experiment; fluorescent probe; chiral recognition

G642.423；O6-339

A

1002-4956(2019)10-0175-04

10.16791/j.cnki.sjg.2019.10.042

2019-02-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201602164）；湖北省教學(xué)研究項(xiàng)目（2017335）；武漢工程大學(xué)教學(xué)研究項(xiàng)目（X2017034）；武漢工程大學(xué)科學(xué)研究項(xiàng)目（K201716）；武漢工程大學(xué)第十二期大學(xué)生校長(zhǎng)基金（2017061）

朱園園（1982—），女，湖北潛江，博士，副教授，主要從事物理化學(xué)的教學(xué)和手性化學(xué)及熒光探針領(lǐng)域的研究。E-mail:yyzhu531@163.com