高效液相色譜法測定茶葉酚酸化合物的含量

屈艷勤，Tukhvatshin Marat，鄭德勇，張 釬，楊江帆，葉乃興*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院，福建 福州 350002)

茶葉是一種健康的飲品，受到越來越多人的喜愛。茶葉中含有豐富的內(nèi)含物，主要有碳水化合物、茶多酚、氨基酸、咖啡堿、茶色素、茶多糖、有機(jī)酸、纖維素以及礦質(zhì)元素等[1]，這些物質(zhì)對人體的生理調(diào)節(jié)和保健具有重要的作用。有機(jī)酸作為茶葉中一種含量較少但卻有重要作用的物質(zhì)，近年來受到越來越多的關(guān)注和研究。有機(jī)酸是茶葉香氣和滋味的主要成分之一，能夠參與茶樹新陳代謝，對茶葉的品質(zhì)具有重要影響[2]。

茶葉中含有種類較多的有機(jī)酸，主要包括草酸、檸檬酸、抗壞血酸、酒石酸、蘋果酸、沒食子酸、水楊酸等。按照其分子結(jié)構(gòu)不同，有機(jī)酸可分為簡單一元羧酸如乙酸、丙酸、丁酸等；二元羧酸和多元羧酸，如蘋果酸，檸檬酸等；酚酸類如：水楊酸、沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸等。目前對茶葉中有機(jī)酸的研究中，以二元羧酸和多元羧酸為主[3,5]，對茶葉中酚酸化合物的研究較少或比較單一。而茶葉中酚酸化合物因易發(fā)生氧化反應(yīng)對茶葉的品質(zhì)有重要的影響，如沒食子酸，能夠參與兒茶素的氧化形成茶黃素類物質(zhì)；綠原酸是具有生物活性的天然防腐劑，具有抗菌、抑菌的作用[6]；咖啡酸和阿魏酸具有抗氧化、抗病毒、抑制癌細(xì)胞、降血脂等功能[7]；水楊酸是植物體內(nèi)普遍存在的一種植物激素，參與并影響植物的多種代謝過程[8]。研究表明[9]，酚酸具有抗氧化、清除自由基、消炎、抗癌等保健功能，因此對茶葉中酚酸化合物的研究具有重要意義。

目前，酚酸化合物的檢測方法主要有薄層色譜法[10-11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13]，高效液相色譜法[14-17]，液相色譜-質(zhì)譜法[18]、毛細(xì)管電泳法[19]等。高效液相色譜法具有分析時間短、靈敏度高、操作方便、結(jié)果可靠等特點，因此是目前比較常用分析方法。高效液相色譜在測定酚酸化合物的過程中，也需要進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，以確保多種酚酸化合物能夠同時測定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶樣為福安大白茶鮮葉及其鮮葉按照不同茶類加工工藝制成的紅茶、綠茶、白茶。

1.2 主要儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，DAD檢測器(型號G1315D)，自動進(jìn)樣器(型號G1329A)(美國Agilent公司)，TC-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm，美國Agilent公司)；Sartorius 電子分析天平(瑞士賽多利斯)；純水機(jī)(美國Millipore公司)；恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SL-250高速粉末機(jī)(浙江省永康市松青五金有限公司)；DHG-9203A型電熱風(fēng)干燥爐(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

乙腈(色譜純)購自默克化工技術(shù)(上海)有限公司；乙酸(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊酸、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、綠原酸、苯甲酸、對香豆酸(純度均大于98%，用于高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)品)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試驗所有超純水由Millipore純水儀制備(美國Millipore公司)。

1.3 樣品制備方法

茶葉樣品加工時間為2018年4月12～17日，福安大白茶一芽三四葉鮮葉原料，按照不同茶類的加工工藝制作而成的紅茶、綠茶、白茶。其加工工藝分別為：(1)白茶樣品的加工方法：將鮮葉薄攤于竹篩上，在30℃下萎凋48 h，然后80℃烘至足干得成品茶。(2)綠茶樣品的加工方法：將鮮葉投入150℃電炒鍋中進(jìn)行炒青，揉捻，120℃下干燥20 min，之后在80℃下烘至足干。(3)紅茶樣品的加工方法：將鮮葉置于竹篩上進(jìn)行萎凋，揉捻，發(fā)酵4 h，在120℃下干燥20 min，之后在80 ℃下烘至足干[20]。茶鮮葉采用微波固樣，固樣時間為70 S，120℃下干燥20 min，之后在80℃下烘至足干。烘干鮮葉及成品茶用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，密封放置于-20℃冰箱中保存。準(zhǔn)確稱取粉碎茶樣0.200 g(精確至0.001 g)置于15 mL聚四氟乙烯離心管中加入10 mL超純水，置于70℃水浴中浸提20 min，冷卻至室溫后以7000 r·min-1的速度離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容至刻度，取待測液1 mL過0.45 μm濾膜，用于高效液相色譜測定。試驗重復(fù)3次。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用水溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1000 mg·L-1的單標(biāo)儲備液。準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，配制成濃度為100 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)測試液，用水逐級稀釋，配制成濃度范圍為0.5～100 mg·L-1系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存于4℃冰箱中備用。

1.5 色譜條件

色譜柱：TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；流動相A相：0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液，流動相B相：乙腈；流速：1.0 mL·min-1。梯度洗脫程序：0～30.0 min，8% B～30% B；30.0～40.0min，30% B～8% B；40.0～45.0 min，8% B。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜波長的選擇

通過紫外吸收光譜圖分析，同時比較8種酚酸化合物在328、280、270、254 nm不同波長下的吸收峰，結(jié)果顯示在328 nm處，咖啡酸、綠原酸、對香豆酸、阿魏酸具有較高的靈敏度，而沒食子酸、水楊酸、苯甲酸、肉桂酸靈敏度較低；在280 nm處，8種酚酸均具有較高的靈敏度，而在270 nm和254 nm處，部分目標(biāo)物出現(xiàn)倒峰，試驗結(jié)果見圖1。因此，為實現(xiàn)多種酚酸化合物是同時測定，試驗中選擇280 nm作為檢測波長。

圖1 不同波長處8種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 8 phenolic acids at different wavelengths注：1沒食子酸；2.綠原酸；3.咖啡酸；4.對香豆酸；5.阿魏酸；6.水楊酸；7.苯甲酸；8.肉桂酸。下同。

2.2 洗脫溶劑的選擇

高效液相色譜法測定酚酸的方法有很多，試驗過程中流動相的種類、pH條件對色譜峰的影響很大。酚酸測定常用的流動相有0.1%乙酸甲醇溶液-0.1%乙酸水溶液[21]；甲醇-0.1%甲酸水溶液[22]；0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈溶液[23]；乙腈- 10 mmol·L-1乙酸銨水溶液[24]等。試驗過程中，考察甲醇-0.1%乙酸、乙腈-0.1%乙酸作為流動相時目標(biāo)物的分離效果，通過梯度洗脫，結(jié)果表明以乙腈-0.1%乙酸水溶液作為流動相時，8種酚酸化合物能夠有效分離且無嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，能夠?qū)崿F(xiàn)定量分析茶葉中酚酸化合物的目的。因此，試驗過程選擇乙腈-0.1%乙酸水溶液作為茶葉中酚酸化合物分離的流動相。結(jié)果如圖2所示。

2.3 柱溫的選擇

色譜柱溫度對目標(biāo)物色譜峰的保留時間和分離具有一定的影響，柱溫升高會加快傳質(zhì)過程，縮小分離度。本試驗考察了不同柱溫下(25、30、35、40、45、50℃)酚酸化合物的分離情況。試驗結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為35℃時，各目標(biāo)物色譜峰之間分離情況較好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL，按照試驗方法中色譜優(yōu)化條件進(jìn)樣分析，以各酚酸進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。8種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度范圍0.50～100 mg·L-1內(nèi)，各組分的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及精密度。

圖2 不同流動相下酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of phenolic acids standards under varied mobile phases

圖3 不同柱溫下8中酚酸化合物的保留時間Fig.3 Retention times of 8 phenolic acids under different column temperatures

結(jié)果表明各標(biāo)準(zhǔn)品在一定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。測定精密度0.80%～1.59%，表明精密度良好。

2.5 樣品回收率測定

在樣品中加入定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.1中樣品制備方法進(jìn)行提取，測定加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，8種酚酸化合物的加標(biāo)回收率95.7%～118.2%，測得回收率良好。

表1 8種酚酸化合物的保留時間、濃度范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及精密度Table 1 Retention times, concentration ranges, standard curves, correlation coefficients, and accuracies of 8 phenolic acids

2.6 樣品含量測定

按照樣品制備方法和色譜條件，對茶樣中酚酸化合物進(jìn)行測定，所得色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖對比如圖4所示。通過比對未知峰和已知酚酸化合物的保留時間以及光譜圖，最終確定樣品的各組分，根據(jù)線性回歸方程計算各組分相應(yīng)的含量，各組分含量分析結(jié)果見表3。

表2 8種酚酸化合物的回收率Table 2 Recovery rates on 8 phenolic acids by newly developed HPLC method

注：ND表示未檢出

圖4 酚酸化合物色譜圖Fig.4 The chromatogram of phenolic acids注：a.標(biāo)準(zhǔn)樣品；b.鮮葉茶樣

表3 茶葉中酚酸化合物的含量Table 3 Recovery rates on 8 phenolic acids by newly developed HPLC method (單位：mg·g-1)

注：ND 表示未檢出，每行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可見，3類茶葉在加工過程中總酚酸化合物的含量都有所提高，總酚酸含量白茶最高(2.87 mg·g-1)，其次是紅茶，綠茶中總酚酸含量最低。3類茶葉以及茶鮮葉中含量較高的是沒食子酸，白茶中含量最高為2.41 mg·g-1，其次是水楊酸和綠原酸；對香豆酸、阿魏酸在茶葉中含量較低，且無顯著性差異；咖啡酸在鮮葉、綠茶和白茶中有檢出，且含量無顯著性差異，在紅茶中未測出，這可能是與紅茶葉加工過程中的發(fā)酵有關(guān)；苯甲酸、肉桂酸在鮮葉以及3類茶葉中均未測出。8種酚酸化合物在茶鮮葉以及3類茶葉中的總含量為2.19～2.87 mg·g-1。

3 結(jié)論與討論

試驗建立一種高效液相色譜法測定茶葉中酚酸化合物的方法，該方法能夠很好的將8種酚酸化合物進(jìn)行分離，且測定精密度在0.80%～1.59%之間，重現(xiàn)性較好。回收率在95.7%～118.2%之間，回收率良好。該方法適用于茶葉中酚酸化合物的測定。通過測定8種酚酸化合物在紅茶、綠茶、白茶的含量，結(jié)果表明，沒食子酸在3類茶葉中含量最高，其次是水楊酸和綠原酸，且總酚酸含量在白茶中最高，綠茶中較低。該方法具有較高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性，能夠?qū)崿F(xiàn)對紅茶、綠茶、白茶三類茶樣中酚酸化合物的同時檢測，為茶葉加工過程中 其它理化成分的分析提供借鑒，也為以后研究其它酚酸化合物在茶葉加工過程中的變化提供參考。