重組Cystatin對冷藏鰱魚的抑菌效果

鐘海霞， 李 冉， 李樹紅， 楊 娟， 胡 強，柯勤勤， 林 靈， 白稚子， 李美良

（四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 625014）

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，產(chǎn)量位居我國淡水魚養(yǎng)殖第二[1]。鰱魚肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，其小包裝生鮮制品食用方便，需求量大，深受廣大消費者的喜愛。然而影響淡水魚初級加工生鮮制品品質(zhì)的因素，除原料的新鮮度外，主要還包括加工方式、貯藏條件及銷售方式等。由于魚肉具有明顯的易腐性，淡水魚生鮮制品的貯藏條件就顯得尤為重要。Gennari M等[2]研究表明在高于凍結溫度的條件下，魚肉隨著細菌的生長繁殖易于腐敗變質(zhì)。通常在特定條件下，魚體所含微生物只有部分參與腐敗過程，這些適宜生存且大量繁殖并產(chǎn)生異味代謝產(chǎn)物的微生物，被稱作特定腐敗菌（specific spoilage organisms，SSO）[3-4]。而魚肉片在有氧低溫貯藏時，同樣是有利于少數(shù)特定優(yōu)勢菌群生存繁殖并產(chǎn)生腐敗相關代謝產(chǎn)物。

假單胞菌是典型的低溫腐敗菌，被認為是有氧冷藏水產(chǎn)品的特定腐敗菌[5]。例如，4℃有氧冷藏草魚肉片[6]以及0～15℃有氧冷藏鯉魚[7]的優(yōu)勢腐敗菌均為假單胞菌。同時，有學者研究發(fā)現(xiàn)有氧冷藏羅非魚[8]、鯧魚[9]、鱘魚[10]的優(yōu)勢腐敗菌均為假單胞菌中且以熒光假單胞菌最為優(yōu)勢。此外，草莓假單胞菌也被發(fā)現(xiàn)是冷藏鯧魚中，僅次于熒光假單胞菌的較優(yōu)勢腐敗菌[9]。

目前尚未見對鰱魚肉片低溫有氧冷藏中優(yōu)勢腐敗菌的檢測。基于上述大量相關文獻，作者利用假單胞菌的選擇性培養(yǎng)基，針對性的篩選并分析了鰱魚肉片4℃有氧冷藏過程中，與致腐最可能相關的假單胞菌的變化趨勢。并且采用生理生化鑒定與16 S rDNA分子鑒定相結合的方法，對貨架期終點假單胞菌中的優(yōu)勢種群進行了分離鑒定。

另一方面，半胱氨酸蛋白酶抑制因子（Cysteine Proteinase Inhibitors，CPIs）可專一性地抑制半胱氨酸蛋白酶，廣泛分布于動植物組織、體液以及分泌液。已知動物源CPIs類群中最主要的Cystatins超家族，包括3個家族，即低分子的Stefin（家族 I）、Cystatin（家族 II）和高分子的 Kininogen（家族Ⅲ）[11]。目前已經(jīng)從魚類卵[12-15]、垂體[16-17]、血清[18]以及皮[19]等多個組織中分離純化了Cystatins。同時，相關研究表明，某些陸生動物及植物來源的Cystatin（家族II）如人類唾液[20]、小鼠[21]、雞蛋白[22]、長春花[23]來源的Cystatin等均表現(xiàn)了抑菌活性。但目前魚源Cystatin（家族II）抑菌活性的研究鮮有報道，作者所在實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)鰱魚重組Cystatin（家族II）能抑制銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的生長[24]。而關于魚源Cystatins對水產(chǎn)品腐敗相關微生物的抑制作用研究，尚未見報道。

為此，作者首先在4℃有氧冷藏鰱魚肉片貨架期終點，通過選擇性培養(yǎng)基對假單胞菌進行了分離、鑒定。并在此基礎上，利用鰱魚重組Cystatin（家族II）的抑菌特性，研究了其對優(yōu)勢假單胞菌的抑菌情況。該結果對于進一步探討將魚源Cystatin開發(fā)為食品防腐劑并針對性地應用于水產(chǎn)品抑菌保鮮的可行性，提供了必要的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

1.1.1 主要原料 鰱魚，購于四川省雅安市農(nóng)貿(mào)市場，每尾約 1.5 kg。 鰱魚重組Cystatin（家族 II）：四川農(nóng)業(yè)大學食品學院水產(chǎn)品加工理論與技術實驗室制備并保存；鰱魚 Cystatin（家族 II）cDNA序列：作者所在實驗室前期在genebank中獲取的登錄號（KF181446）[24]。

1.1.2 培養(yǎng)基 PCA培養(yǎng)基、假單胞菌選擇性培養(yǎng)基CFC：青島海博生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 Taq DNA聚合酶、DNA Marker III、Taq buffer、dNTP、細菌基因組DNA提取試劑盒-離心柱型：天根生化科技北京有限公司產(chǎn)品；16S rDNA細菌通用引物：上海英濰捷基生物技術有限公司產(chǎn)品。

注：*16S rDNA細菌通用引物序列如下：正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 反向引物 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

1.2 主要儀器與設備

MyCycler TM Thermal Cycler PCR儀：美國Bio-Rad產(chǎn)品；水平電泳槽及電泳電源、Dio-Gel-2000凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad產(chǎn)品；CX21FS1顯微鏡：日本Olympus產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚肉片的加工及低溫有氧冷藏 將鮮活鰱魚經(jīng)宰殺去頭去內(nèi)臟后，用流動冷卻自來水洗去魚體表面的黏液、雜質(zhì)，腹腔內(nèi)血污，隨后去皮，去脊骨，取魚片，整形，所得每塊魚片質(zhì)量為60～70 g。加工完成的魚肉片，置于PP一次性冷鮮肉塑料托盤，然后用食品級保鮮膜封口包裝，置于4℃下冷藏。

1.3.2 鰱魚肉片4℃低溫有氧冷藏期間的感官分析 由6名經(jīng)過訓練的專業(yè)人員組成感官評價小組，對鰱魚肉片進行感官評分，以確定其貨架期終點。以色澤、氣味、組織形態(tài)、組織彈性為指標，采用5 分法評定[25]。

1.3.3 鰱魚肉片低溫有氧冷藏期間細菌總數(shù)及假單胞菌的變化 在鰱魚肉片有氧冷藏期間，從冷藏初期到貨架期終點，每隔24 h從鰱魚肉片中取樣。取樣微生物計數(shù)參照GB/T 4789.20-2003：食品衛(wèi)生微生物學檢驗水產(chǎn)食品檢驗方法[26]。

在無污染的環(huán)境中用經(jīng)高溫滅菌并冷卻后的手術刀剪取腐敗鰱魚魚肉25 g，放入已滅菌的研缽內(nèi)用無菌剪刀剪碎，而后加入無菌玻璃砂后研磨，再放入盛有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，震蕩搖勻，梯度稀釋后，采用PCA培養(yǎng)基及CFC培養(yǎng)基對4℃冷藏過程中鰱魚肉片中的細菌總數(shù)（37℃，48 h）、假單胞菌（30 ℃，48 h） 進行培養(yǎng)及計數(shù)，每個實驗做3個重復。

1.3.4 菌株的純培養(yǎng) 用無菌接種環(huán)挑取若干貨架期終點CFC培養(yǎng)基上具有典型菌落形態(tài)的單菌落，連續(xù)進行3次劃線純化培養(yǎng)。

1.3.5 菌株的鑒定

1）形態(tài)特征鑒定 觀察單菌落的形態(tài)，并挑取培養(yǎng)16～18 h長勢好的單菌落，通過革蘭氏染色后觀察記錄細菌形態(tài)，顏色質(zhì)地及有無芽孢等[27]。

2）生理生化特征鑒定 參照《伯杰細菌鑒定手冊》[28]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[29]對分離純化的細菌進行生理生化實驗。

3）分子生物學鑒定 將分離純化的菌株活化2次，30℃180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h，參照說明書方法采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取模板DNA以通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行擴增。

PCR擴增反應體系包括：2 μL DNA模板，引物27F 0.5 μL， 引 物 1492R 0.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.4 μL，ddH2O 12.6 μL，Super Pure dNTP 4 μL，Taq Buffer（10×）5 μL。

PCR擴增程序為：95℃變性5 min，接著30個循環(huán)（94℃變性45 s、56℃退火 45 s、72℃延伸1.5 min）。最終72℃延伸10 min，取適量PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，而后將擴增產(chǎn)物送至上海立菲生物技術有限公司進行測序，將測得的16 S rDNA序列提交至GeneBank獲取登錄號，并在NCBI （（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫中進行在線BLAST同源性比對，選取同源性較高的菌株序列使用MEGA 6.0軟件采用鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 菌株致腐能力鑒定

1）TVB-N值的測定 用無菌水將分離純化的假單胞菌中的優(yōu)勢菌株分別制成菌懸液，菌體濃度105CFU/mL。根據(jù)Herber等的方法[30]，制備無菌魚塊，在表面回接菌懸液。4℃貯藏，并進行揮發(fā)性鹽基氮 （TVB-N）的測定，具體方法參照SC/T3032-2007：水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定[31]。

2）感官評分 將分離純化的假單胞菌優(yōu)勢菌株回接到鰱魚肉片表面，對其進行感官評分[25]。

1.3.7 鰱魚重組Cystatin的抑菌活性檢測

1）濾紙片法 將篩選的優(yōu)勢腐敗菌置入無菌水中制成菌懸液，濃度為105CFU/mL，取0.1 mL菌液涂布于牛肉膏瓊脂糖凝膠平板上[22]。將濾紙片（直徑6 mm）放置于上述已涂布細菌的平板上，在濾紙片上分別滴加經(jīng)無菌處理的 15、20、25、30 u/片的Cystatin；同時以等體積的無菌生理鹽水（質(zhì)量分數(shù)0.85%NaCl）做空白對照。在4℃下靜置3 h，37℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，測定抑菌圈的大小以判斷鰱魚重組Cystatin的抑菌效果。

2）營養(yǎng)肉湯法 將分離的優(yōu)勢腐敗菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于30℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，使其在600 nm的吸光值達到0.6左右，此時菌懸液的濃度約1×108CFU/mL。將鰱魚重組Cystatin分別稀釋至 80、105、135 μg/mL 后添加到含 1×108CFU/mL優(yōu)勢菌的菌懸液的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于30℃振蕩培養(yǎng)，對照組不添加Cystatin，空白對照添加Cystatin不加菌。 每個濃度分別在 0、1、2、3、4、5、6、20 h 于600 nm測其菌懸液的吸光值。最終以采樣時間為橫坐標，600 nm吸光值為縱坐標，繪制曲線。

2 結果與討論

2.1 鰱魚肉片4℃低溫有氧冷藏期間的感官分析

對4℃有氧冷藏期間鰱魚肉片進行感官分析，結果見圖1。在冷藏0～3 d內(nèi)，鰱魚肉片的感官評分均大于4分，冷藏至第6 d時評分為2.6分，魚肉片品質(zhì)尚可接受。但第7 d時評分為2分，說明魚片開始腐敗變質(zhì)，其感官不可被接受。由此判斷4℃有氧冷藏鰱魚肉片的貨架期終點為7 d。

圖1 鰱魚肉片在4℃冷藏過程中的感官評定Fig.1 Change in sensory score during chilled storage of Silver carp fillets

2.2 鰱魚肉片4℃有氧冷藏期間細菌總數(shù)及假單胞菌的變化

由圖2可知，鰱魚肉片在4℃冷藏0～7 d期間，細菌總數(shù)對數(shù)值由初始的3.57上升至7.29，超出了淡水魚細菌總數(shù)對數(shù)值可接受的最大限度7.0[6]，說明冷藏7 d時魚片進入初期腐敗，達到貨架期終點，此結果與感官分析結果一致。假單胞菌數(shù)對數(shù)值在整個冷藏期間，一直呈明顯的上升趨勢，貨架期終點時達到6.77，接近細菌總數(shù)值。說明該類低溫腐敗菌在冷藏鰱魚肉片貨架期終點時占有絕對的種群優(yōu)勢。

有學者研究表明，4℃有氧冷藏草魚肉片[6]、0～15℃有氧冷藏鯉魚[7]以及有氧冷藏羅非魚[8]、鯧魚[9]、鱘魚[10]的優(yōu)勢腐敗菌均為假單胞菌。

圖2 鰱魚肉片4℃冷藏期間細菌總數(shù)及假單胞菌數(shù)變化Fig.2 Changesin totalnumber ofbacteria and Pseudomonas chilled storage of Sliver carp fillets

2.3 貨架期終點腐敗相關假單胞菌及其菌落的形態(tài)特征

從冷藏7 d的CFC培養(yǎng)基上，挑取30個具有典型、一致的菌落特征的單菌落，經(jīng)多次劃線純化后得到30株菌株，依次將其命名為J-1～J-30進行菌落及菌株形態(tài)觀察。發(fā)現(xiàn)這30株菌菌落及菌株形態(tài)相似，主要表現(xiàn)為在CFC培養(yǎng)基上生長呈圓形、乳白色、邊緣整齊、菌落隆起、半透明的光滑型菌落，經(jīng)革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)，其為G-的直或稍彎桿菌，無芽孢。

2.4 貨架期終點腐敗相關假單胞菌株的生理生化鑒定

對J-1～J-30進行生理生化鑒定，其中19株菌（J1-J19）生理生化特征一致，且可以產(chǎn)熒光素，占分離菌株數(shù)的63.3%。其余8株菌（J20-J27）特征一致占分離菌株數(shù)的26.7%。另有3株（J28-J30）未得到鑒定 占分離菌株數(shù)的10%。因此分別選取J-4和J-22為代表，進行后續(xù)實驗。

2.5 腐敗菌的分子生物學鑒定

經(jīng)BLAST同源性匹配之后，選取同源性較高的菌株序列構建發(fā)育樹。

根據(jù)構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，J-4（登錄號 KF056821）與熒光假單胞菌（pseudomonasfluorescens）聚集在同一分支，與Pseudomonas fluorescensG27（KT767924.1）相似度在 99%以上，J-22 （登錄號KX923798） 和草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）屬于同一類群，與Pseudomonas fragiATCC 4973（NR_024946.1）相似度為 99%。 選擇相似度最高的幾種假單胞菌和希瓦氏菌Shewanella putrefaciensATCC 8071（NR_119141.1）、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC 12600（NR_115606.1）序列，構建該菌株的系統(tǒng)進化樹，進一步證明J-4、J-22菌株屬假單胞菌屬。因此進一步結合形態(tài)學及理化實驗結果，確定分離純化得到的2類優(yōu)勢假單胞菌分別為熒光假單胞菌（pseudomonas fluorescens）和草莓假單菌（Pseudomonas fragi）。

圖3 優(yōu)勢假單胞菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of dominant putrefying pseudomonas

2.6 腐敗菌致腐能力的初步分析

由圖4可知，回接兩種假單胞菌的鰱魚肉片在4℃冷藏過程中，TVB-N值一直呈明顯的上升趨勢，對回接熒光假單胞菌的鰱魚肉片冷藏至第4 d品質(zhì)開始劣變，5 d時TVB-N值超過25 mg/hg進入初期腐敗狀態(tài)，冷藏第6 d鰱魚肉片TVB-N值高達34.62 mg/hg，已經(jīng)徹底進入腐敗狀態(tài)，對其進行感官分析發(fā)現(xiàn)回接該菌的鰱魚肉片在冷藏第5 d色澤暗淡，產(chǎn)生明顯異味，彈性損失嚴重，評分為2，而回接草莓假單胞菌的鰱魚肉片冷藏至第4 d時TVBN值為17.76 mg/hg品質(zhì)開始下降，第6 d時TVBN值達到26.95 mg/hg，鰱魚肉片開始腐敗，結合感官分析發(fā)現(xiàn)接有草莓假單胞菌組直到第6 d，才開始產(chǎn)生異味，評分達到2。由此可見，感官評定結果與TVB-N值的變化結果基本吻合。

圖4 回接優(yōu)勢假單胞菌對TVB-N值的影響Fig.4 Effect of dominant Pseudomonas on TVB-N Value

由上述結果可知，分離得到J-4熒光假單胞菌和J-22草莓假單胞菌都是引起冷藏鰱魚肉片腐敗的相關菌，回接后均不同程度的加快了鰱魚肉片的腐敗速度，且回接熒光假單胞菌的去皮鰱魚魚肉片腐敗速度明顯快于回接草莓假單胞菌組。由此，可初步斷定對于4℃冷藏鰱魚肉片，熒光假單胞菌的致腐能力優(yōu)于草莓假單胞菌。同時，貨架期終點分離的各類腐敗相關假單胞菌株的比例數(shù)（熒光假單胞菌63.3%，草莓假單胞菌26.7%），因此，說明貨架期終點時，腐敗相關假單胞菌中優(yōu)勢菌次序為熒光假單胞菌、草莓假單胞菌。

假單胞菌是典型的低溫腐敗菌，被認為是有氧冷藏水產(chǎn)品的特定腐敗菌[5]。相關研究也表明，熒光假單胞菌、草莓假單胞菌分別是0℃冷藏三文魚[32]，冷藏海鱸魚[33]的優(yōu)勢腐敗菌。此外，0～10℃冷藏羅非魚[8]、冷藏鯧魚[9]的優(yōu)勢腐敗菌均為假單胞菌，且熒光假單胞菌均為最優(yōu)勢種群，其中貨架期終點的冷藏鯧魚中熒光假單胞菌明顯多于草莓假單胞菌[9]。

2.7 抑菌活性的測定

2.7.1 濾紙片法鑒定Cystatin的抑菌作用 重組鰱魚Cystatin對熒光假單胞菌、草莓假單胞菌均具有明顯抑菌效果，當Cystatin的添加量為15、20、25、30 u/片時，對熒光假單胞菌抑菌圈直徑分別為18、21、23、33 mm（如圖 5），對草莓假單胞菌抑菌圈直徑分別為 10、15、21、27 mm（如圖 6）。 Tumenoto[21]發(fā)現(xiàn)鼠Cystatin S能有效抑制牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）， 當添加量為 75 μg/片時，抑菌圈直徑為14 mm；Wesierska[22]等研究發(fā)現(xiàn)雞蛋白Cystatin對銅綠假單胞菌抑菌效果明顯，當Cystatin添加量為 120 μg/片時抑菌圈直徑為16 mm，150 μg/片時抑菌圈直徑達到 18 mm。

圖5 Cystatin對熒光假單胞菌的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect from Cystatin to Pseudomonas fluorescens

圖6 Cystatin對草莓假單胞的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect from Cystatin to Pseudomonas fragi

2.7.2 營養(yǎng)肉湯法鑒定Cystatin的抑菌作用 將不同濃度的Cystatin分別與熒光假單胞菌、草莓假單胞菌于30℃共同培養(yǎng)后，并分別測定A600nm值，結果如圖7、圖8所示。由圖可知，隨著Cystatin加量的增加，A600nm值逐漸降低。當Cystatin加量一致時，添加熒光假單胞菌的組A600nm值始終低于添加草莓假單胞菌的組。以上結果表明，Cystatin加量越大對熒光假單胞菌和草莓假單胞菌的抑制作用越明顯，并且Cystatin對熒光假單胞菌的抑制效果較草莓假單胞菌好。

圖7 Cystatin抑制熒光假單菌曲線Fig.7 Curve of Cystatin inhibition on Pseudomonasfluorescens

圖8 Cystatin抑制草莓假單菌曲線Fig.8 Curve of Cystatin inhibition on Pseudomonas fragi

有研究發(fā)現(xiàn)，重組芋頭球莖Cystatin在80 μg/mL質(zhì)量濃度下能抑制齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）的菌絲生長，150～200 μg/mL質(zhì)量濃度能完全抑制菌絲體生長[34]。雞蛋白Cystatin對魯氏不動桿菌（Acinetobacter lwoffii）、大腸桿菌（Escherichia coli）、寡源桿菌屬（Oligella）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有抗菌活性，當雞蛋白Cystatin的質(zhì)量濃度在100～200 μg/mL之間時，能徹底抑制上述菌株的生長[22]。

Cystatin作為一種分泌型抑制劑，其抑制假單胞菌的機制，一方面可能是通過抑制細菌本身分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶而發(fā)揮抑菌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，向能夠分泌胞外半胱氨酸蛋白酶的細菌培養(yǎng)液中加入雞蛋白Cystatin后細菌的生長受到大幅度的抑制[22]。另一方面，Cystatin N端和半胱氨酸蛋白酶相互作用的保守序列與細菌微生物膜上的負電荷相結合發(fā)揮抑菌作用[35]。此外，Cystatin還可能穿透細菌細胞膜，進入細菌內(nèi)部，抑制胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶。其具體抑菌機制有待進一步研究。

3 結語

對4℃有氧冷藏鰱魚肉片貨架期終點的腐敗假單胞菌進行了分離鑒定，并且研究了鰱魚重組Cystatin對其抑菌作用。初步確定了典型低溫腐敗菌——假單胞菌為4℃有氧冷藏鰱魚肉片貨架期終點的優(yōu)勢菌群，并且熒光假單胞菌（pseudomonasfluorescens）在數(shù)量比例和致腐能力方面均優(yōu)于草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi），該結果可為靶向抑制鰱魚腐敗相關菌，確定目標。抑菌研究證實了鰱魚重組cystatin對4℃有氧冷藏鰱魚肉片貨架期終點的兩種相關腐敗假單胞菌均具有明顯的抑制效果，且呈劑量依賴關系，有望為開發(fā)天然安全的水產(chǎn)品抑菌劑提供理論依據(jù)。