十二井穴放血對(duì)腦梗死小鼠腦水腫及端粒生物合成的影響

涂 悅

腦梗死作為臨床常見(jiàn)的一種腦血管病，其較高的致殘率和致死率給病人及社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。而腦梗死后繼發(fā)的腦水腫是致殘和致死的重要原因之一，因此有效的控制腦水腫是治療腦梗死的關(guān)鍵[1]。有研究表明，十二井穴放血療法對(duì)改善腦梗死后腦水腫有一定療效，但相關(guān)機(jī)制仍未闡明[2]。端粒是染色體末端的一段非編碼重復(fù)序列，其隨年齡增加及氧化應(yīng)激、炎癥等因素的累積而不斷縮短，當(dāng)縮短到一定程度時(shí)則會(huì)造成細(xì)胞凋亡，加重腦損傷[3]。這提示端?？赡苁鞘ǚ叛煼òl(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建腦缺血再灌注小鼠模型，以探討十二井穴放血療法對(duì)腦水腫的影響，同時(shí)進(jìn)一步檢測(cè)端粒長(zhǎng)度和端粒生物合成的相關(guān)基因表達(dá)，從而為挖掘十二井穴放血療法治療腦梗死的機(jī)制提供更多的基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 C57BL雄性小鼠36只，30～35 g，購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。RNA/DNA共提取試劑盒(北京天根公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根公司)，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(北京天根公司)，real-time PCR儀(StepOne Plus，美國(guó)ABI公司)，小動(dòng)物麻醉機(jī)(深圳瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的構(gòu)建 將小鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、大腦中動(dòng)脈栓塞組(MCAO組)和井穴放血組，每組12只。MCAO組和井穴放血組采用線栓法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈栓塞模型：以400 mL/min的3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，隨后改為2%濃度持續(xù)麻醉。取頸正中切口，分離并暴露右側(cè)頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處。結(jié)扎頸外動(dòng)脈并在頸內(nèi)動(dòng)脈上打一活結(jié)暫不結(jié)扎，為稍后固定線栓做準(zhǔn)備。于頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處遠(yuǎn)端結(jié)扎以阻斷血流，在分叉處近端夾一動(dòng)脈夾，而后在頸總動(dòng)脈結(jié)扎線和動(dòng)脈夾之間剪一切口，將線栓從切口插入至動(dòng)脈夾處，此時(shí)將頸總動(dòng)脈連同線栓一同結(jié)扎，松緊以不影響線栓的移動(dòng)為宜，撤去動(dòng)脈夾，將線栓繼續(xù)向頸內(nèi)動(dòng)脈插入1 cm左右，此時(shí)結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈上的套線以固定線栓，縫合皮膚，并在體外留有線栓的另一頭。1 h后緩慢撥出部分線栓，剪斷體外部分。

1.2.2 十二井穴放血 參考相應(yīng)的人體穴位解剖標(biāo)志，用1 mL注射器針刺小鼠雙前肢趾尖端的十二井穴，出血量約為每穴10 μL，每日2次，共6次。

1.2.3 改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分(mNSS)及標(biāo)本采集 3組小鼠均于術(shù)后72 h行mNSS評(píng)分[4]，0分為正常，18分為最嚴(yán)重，分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明癥狀越嚴(yán)重。評(píng)分后立即處死小鼠，各組均取缺血半暗帶同一位點(diǎn)約10 mg腦皮質(zhì)，進(jìn)行DNA/RNA的提取，剩余腦組織進(jìn)行含水量測(cè)量。

1.2.4 相關(guān)基因表達(dá)及端粒拷貝數(shù)測(cè)定 提取腦組織基因組DNA和總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)，端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1/2(telomeric repeatbinding factor 1/2，TRF1/2)以及端粒長(zhǎng)度。方法如下：配制25 μL PCR反應(yīng)體系，其中樣本量為cDNA 10 ng或基因組DNA 50 ng，每個(gè)基因均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件為兩步法：95 ℃ 10 min預(yù)變性，隨后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量，各基因引物序列如下，TERT上游：AGTGGTGAACTTCCCTGTGG，下游：CAACCGCAAGACTGACAAGA；TRF1上游：TACCAAACTCAAGCCCCATC，下游GCAGCAAACTCACATCGAAA；TRF2上游TGAAGTTCGCATTTTGATGGC，下游：CTTTGGTCCTGGCATCTCTAC；端粒上游：GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT，下游：TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA；GAPDH上游：TACACTGAGGACCAGGTTG，下游：CCCTGTTGCTGTAGCCATA；36B4上游：TGTGTTAGGGGACTGGTGGACA，下游：CATCACCCACTTACCCCCAAAA。

1.2.5 腦組織含水量測(cè)定 取腦后去除小腦及腦干，立即稱重所得質(zhì)量為濕重。隨后將其放至烘箱中75 ℃烘烤48 h，稱重，所得為干重。含水量=(濕重-干重)/濕重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，3組比較采用單因素方差分析，進(jìn)行兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能損傷 腦缺血再灌注后小鼠mNSS評(píng)分均顯著升高，應(yīng)用井穴放血后，井穴放血組mNSS顯著低于MCAO組(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.2 各基因表達(dá)及端粒長(zhǎng)度變化 與對(duì)照組比較，MCAO組和井穴放血組小鼠端粒長(zhǎng)度顯著降低，TERT、TRF1和TRF2基因表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；與MCAO組比較，井穴放血組小鼠端粒長(zhǎng)度增加，TRET、TRF1和TRF2基因表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.3 腦組織含水量 MCAO組和井穴放血組小鼠腦組織含水量與對(duì)照組比較均顯著增高，井穴放血組顯著低于MCAO組(均P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

組別只數(shù)mNSS評(píng)分(分) TERT TRF1 TRF2 端粒長(zhǎng)度腦組織含水量MCAO組127.35±2.641) 1.74±0.401)3.33±0.891)3.02±0.651)0.51±0.161)0.792±0.0061)井穴放血組124.75±1.451)2)2.84±0.561)2)4.70±0.951)2)4.69±0.951)2)0.75±0.111)2)0.779±0.0081)2)對(duì)照組120 1.14±0.27 0.99±0.391.10±0.171.09±0.200.760±0.007

與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與MCAO組比較，2)P<0.05

3 討 論

井穴位于四肢的末端，是十二經(jīng)脈氣血的起始之處，針刺該處可促進(jìn)氣血運(yùn)行，有起死回生救急之妙用[2]。腦水腫是腦梗死后常見(jiàn)并發(fā)癥，一般于發(fā)病后2～4 d達(dá)到高峰，主要由細(xì)胞缺血缺氧造成的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)所引起，導(dǎo)致顱內(nèi)壓急劇升高，使病情加重，甚至造成腦疝，威脅生命[5]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)應(yīng)用井穴放血療法后，可有效減輕腦梗死小鼠的神經(jīng)功能損傷癥狀，同時(shí)也減輕了腦梗死后的腦水腫，表明在腦梗死時(shí)應(yīng)用井穴放血療法可發(fā)揮一定的腦保護(hù)作用。這與阮建國(guó)等[6]得出的結(jié)論一致，其發(fā)現(xiàn)在常規(guī)西藥的基礎(chǔ)上，加用十二井穴放血療法可有效改善腦梗死病人的日常生活能力及神經(jīng)功能；滕安琪等[7]也發(fā)現(xiàn)十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)急性腦梗死病人早期運(yùn)動(dòng)功能和日常生活活動(dòng)能力恢復(fù)有明顯的促進(jìn)作用，但上述研究并未深入探討其潛在機(jī)制。端粒是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控凋亡啟動(dòng)的重要基因序列，當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短至一定程度時(shí)，可通過(guò)抑制線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，造成線粒體功能障礙，進(jìn)而通過(guò)端粒-線粒體途徑引起腦水腫，造成細(xì)胞凋亡[8]。為此實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測(cè)了缺血半暗帶腦組織中端粒生物合成相關(guān)基因的表達(dá)及端粒長(zhǎng)度的變化，以探索十二井穴放血療法發(fā)揮腦梗死后腦保護(hù)作用的潛在靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦梗死后腦組織中端粒長(zhǎng)度明顯縮短，且腦水腫明顯，表明腦缺血可通過(guò)導(dǎo)致端粒損傷而加重腦水腫。當(dāng)機(jī)體因腦缺血而進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，活性氧族及炎癥因子的增加可直接損傷端粒，受損的端粒通過(guò)誘導(dǎo)P53基因的表達(dá)，激活線粒體凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞毒性腦水腫的發(fā)生[9]。同時(shí)這些因子還可抑制端粒酶及端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2的活性，削弱端粒修復(fù)系統(tǒng)的功能，促進(jìn)端粒加速縮短[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)腦梗死小鼠腦組織中TERT、TRF1和TRF2基因表達(dá)升高，這可能是端粒修復(fù)系統(tǒng)受到抑制時(shí)，端粒生物合成相關(guān)基因發(fā)生代償性升高的結(jié)果。應(yīng)用井穴放血后，腦梗死小鼠TERT、TRF1和TRF2基因表達(dá)進(jìn)一步升高，且端粒長(zhǎng)度明顯延長(zhǎng)，表明十二井穴放血療法可能是通過(guò)激活端粒生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)端粒的修復(fù)，從而減少細(xì)胞凋亡及線粒體功能障礙，增加細(xì)胞能量供應(yīng)的同時(shí)減輕腦水腫嚴(yán)重程度，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腦梗死小鼠模型，探討了井穴放血療法對(duì)腦水腫及端粒生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，為探索十二井穴放血發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制提供了基礎(chǔ)研究，或許可為腦梗死的臨床治療以及井穴放血療法的臨床應(yīng)用提供一定的幫助。