復(fù)方交泰湯對心腎綜合征模型大鼠心功能的影響

心腎綜合征(cardiorenal syndrome，CRS)是指慢性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)引起進(jìn)行性腎功能損害，是CHF的終末期表現(xiàn)。中醫(yī)認(rèn)為CHF發(fā)展到終末期與心、腎兩臟關(guān)系最為緊密。臨床研究顯示，中醫(yī)經(jīng)典的交通心腎法能夠延緩心腎綜合征進(jìn)展[1-2]。本研究以單側(cè)腎臟切除(UNX)聯(lián)合冠狀動脈結(jié)扎(MI)的方法制備心腎綜合征大鼠模型，以交通心腎法代表方復(fù)方交泰湯為干預(yù)手段，觀察復(fù)方交泰湯對心腎綜合征大鼠心臟功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級6周齡雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量200～250 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2011-0012]。北京醫(yī)科大學(xué)心血管病研究所動物室飼養(yǎng)，室溫20～21 ℃，濕度50%。

1.2 藥物 復(fù)方交泰湯由肉桂、黃連、豬苓、澤瀉、滑石、生黃芪等組成中藥免煎顆粒(江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司)；奧美沙坦酯片[批號：SN071OA，第一三共(中國)投資有限公司贈予]20 mg。

1.3 試劑與主要設(shè)備 ALC-V9小動物呼吸機(jī)(上海奧爾特生物科技有限公司)；NANODROP 2000和MK3酶標(biāo)儀(ThermoFisher公司)；CX50超聲診斷儀(Philip公司)；ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)；B型鈉尿肽(BNP)檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)；引物α-MHC-F：AGAAGGAGCAGGACACCAGC，α-MHC-R：GTGGGATA GCAACAGCGAGGC；β-MHC-F：AGGAACAGGCCAACACCAAC，β-MHC-R：CAAAGGCTCCAGGTCTCAGG；GAPDH-F：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，GAPDH-R：ATGGTGGTGAAGACGCCAG TA(上海生工生物工程有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，參照文獻(xiàn)[3-4]行右腎摘除術(shù)，1周后行左冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)制備心肌梗死模型。對照組只進(jìn)行右腎摘除術(shù)和左側(cè)開胸手術(shù)。常規(guī)飼養(yǎng)4周，評價(jià)造模是否成功。以大鼠出現(xiàn)倦怠、活動減少、反應(yīng)遲緩、呼吸增快、食欲下降、稀便等表現(xiàn)，心臟超聲左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<45%為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 分組 將大鼠隨機(jī)分為4組，其中模型組、奧美沙坦酯組、復(fù)方交泰湯組每組20只；對照組10只。

1.4.3 給藥方法 依據(jù)《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》體表面積劑量換算方法，奧美沙坦酯組灌服奧美沙坦酯，0.5 mg/100 g，每日1次；復(fù)方交泰湯組灌服復(fù)方交泰湯(蒸餾水溶解，60 ℃震蕩，形成混懸液，濃度為2 g/mL)15 g/kg，每日1次；對照組及模型組灌服等量生理鹽水，每日1次。周期為8周。

1.4.4 標(biāo)本采集 療程結(jié)束，小動物氣體麻醉機(jī)麻醉大鼠，眼眶后靜脈叢取血2 mL，3 000 r/min，離心15 min，分離血清；取出大鼠心臟，剝離心包、心房及右心室，鹽水漂洗，稱重，取大鼠非梗死區(qū)心臟組織置于凍存管液氮中保存。

1.4.5 心功能檢測 按照試劑盒說明書操作步驟，應(yīng)用MK3酶標(biāo)儀檢測血清BNP濃度；氣體麻醉機(jī)麻醉大鼠，使用7.5 MHz超聲探頭，獲取胸骨旁左室長軸二維圖像及左室M型曲線，掃描速度100 mm/s，測量3個(gè)心動周期，得到左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(LVFS)和LVEF。

1.4.6 組織mRNA測定 取大鼠非梗死區(qū)心臟組織1 g，液氮研磨粉碎，按照TRIZOL試劑說明書操作步驟提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，進(jìn)行PCR檢測，觀察肌球蛋白(MHC)mRNA表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)過程中對照組大鼠死亡2只，死亡率為20%；模型組大鼠死亡9只，死亡率為45%；奧美沙坦組死亡6只，死亡率為30%；復(fù)方交泰湯組死亡5只，死亡率為25%。

2.1 各組BNP及心功能指標(biāo)比較(見表1)

組別只數(shù)BNP(ng/L)LVEDD(μm)LVESD(μm)LVEF(%)LVFS(%)對照組 81 493.7±331.175.65±13.4054.24±14.5859.18±12.6726.81±13.08模型組 111 356.7±501.296.25±21.371)76.63±21.931)48.55±12.821)7.61±11.651)奧美沙坦酯組14990.6±412.21)2)79.46±25.592)62.20±21.372)49.75±7.6113.70±10.822)復(fù)方交泰湯組151 058.3±338.51)2)86.15±15.102)65.06±15.812)54.71±12.942)16.45±13.422)

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.2 各組肌球蛋白mRNA表達(dá)水平比較(見表2)

組別α-MHCβ-MHCα-MHC/β-MHC模型組 1.25(0.48,1.78)0.86(0.41,3.27)1.11(0.28,3.75)奧美沙坦酯組2.85(0.51,5.09)0.35(0.11,3.63)2.70(0.43,8.93)復(fù)方交泰湯組0.76(0.35,2.16)0.47(0.80,3.59)1.92(0.34,7.00)

3 討 論

文獻(xiàn)及臨床研究提示心腎綜合征發(fā)病核心是心腎不交[5]。復(fù)方交泰湯以《韓氏醫(yī)通》復(fù)方交泰丸加減合調(diào)陰陽，使心腎水火陰陽二氣相交。臨床研究證實(shí)能夠延緩心腎綜合征病人心腎功能的惡化，其可能機(jī)制是拮抗CHF進(jìn)程中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)和炎癥反應(yīng)[6]。目前認(rèn)為RAAS過度激活是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的核心因素，除影響心室收縮力、心室重構(gòu)，還能夠啟動血管、組織免疫炎癥程序，而這二者的共同結(jié)局是心腎纖維化。本研究以RAAS拮抗劑奧美沙坦酯為陽性對照藥物，觀察復(fù)方交泰湯改善心腎綜合征大鼠心臟功能的作用。

BNP是由心肌細(xì)胞合成的具有生物學(xué)活性的天然激素。當(dāng)左心室功能不全時(shí)，由于心肌擴(kuò)張，心臟容量負(fù)荷或者壓力發(fā)生改變，心肌細(xì)胞釋放的前腦鈉肽原被迅速分解為有生物活性的BNP[7]，快速釋放入血以維持循環(huán)系統(tǒng)壓力、滲透壓及容量的穩(wěn)態(tài)。血清中BNP水平與慢性心力衰竭程度與時(shí)間呈正相關(guān)[8-10]。LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS是心臟超聲直接反映心臟左室結(jié)構(gòu)變化和收縮功能的指標(biāo)，間接反映心室重構(gòu)。本研究中，模型組LVEDD、LVESD高于對照組，LVEF、LVFS低于對照組(P<0.05)，說明單側(cè)腎臟切除聯(lián)合冠狀動脈結(jié)扎方法復(fù)制心腎綜合征大鼠模型的可重復(fù)性。治療后，奧美沙坦酯組和復(fù)方交泰湯組BNP 水平降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組BNP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示復(fù)方交泰湯能夠改善心臟功能，與奧美沙坦酯作用相似。兩組LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高。說明經(jīng)藥物治療的大鼠心臟有改善的趨勢，BNP水平降低是心功能得到改善的結(jié)論，再次證實(shí)復(fù)方交泰湯在改善心臟結(jié)構(gòu)與收縮功能方面與奧美沙坦酯作用相當(dāng)。

肌球蛋白是重要的心肌收縮蛋白，成年大鼠心室肌以α-MHC為主，心力衰竭發(fā)生時(shí)β-MHC基因表達(dá)增加，使得β-MHC所占總肌球蛋白的比例增加。由于β-MHC與肌動蛋白的親和力低于α-MHC，故以β-MHC為主的心肌收縮力減弱，收縮速度減慢。同時(shí)β-MHC升高與心房、心室內(nèi)徑顯著正相關(guān)，故而認(rèn)為其表達(dá)異常，還參與了心臟重塑[11-12]。本研究結(jié)果表明奧美沙坦酯能夠上調(diào)心腎綜合征大鼠心肌α-MHC mRNA水平，未明顯降低β-MHC mRNA的表達(dá)，進(jìn)而使得α-MHC/β-MHC升高。雖然心腎綜合征大鼠經(jīng)復(fù)方交泰湯治療后α-MHC未見明顯升高，但卻見到β-MHC的下降和α-MHC/β-MHC升高的趨勢，提示本方可能改善心腎綜合征大鼠的心室重構(gòu)。

綜上所述，復(fù)方交泰湯能夠改善心腎綜合征模型大鼠心臟功能，降低心腎綜合征模型大鼠血清BNP水平，與奧美沙坦酯作用相當(dāng)，其機(jī)制可能是通過改善心室重構(gòu)，尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。