基于PCR-毛細(xì)管電泳法對1例5結(jié)節(jié)肝細(xì)胞癌克隆起源的檢測分析

朱玉瑤 陳佳 叢文銘

（海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬上海東方肝膽外科醫(yī)院病理科 上海 201805）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是我國常見的肝臟惡性腫瘤，本課題組曾較早開展了多結(jié)節(jié)性HCC克隆特點(diǎn)研究，提出了單克?。↖M型）和多克?。∕O型）兩大起源模式[1-2]。IM型是指肝內(nèi)殘留癌細(xì)胞的復(fù)燃生長，而MO型本質(zhì)上為一個新生肝臟腫瘤。本研究采用熒光PCR-毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測了周邊肝組織及HCC的5個獨(dú)立結(jié)節(jié)，分析周邊肝組織與腫瘤組織各個結(jié)節(jié)的克隆起源。

1.材料與方法

1.1 樣本信息

選取海軍軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院收治一例原發(fā)性肝癌標(biāo)本，因體檢發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白386.5ng/ml，CT提示肝左葉占位，行“左肝部分切除術(shù)”。

1.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇：

根據(jù)文獻(xiàn)與HCC克隆起源相關(guān)的基因，以及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的抑癌基因，選取了10個微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行檢測，并采用不同熒光標(biāo)記對引物進(jìn)行標(biāo)記[3]。位點(diǎn)信息為如 下：FAM標(biāo) 記 的D8S520、D16S514、D8S246、D16S419、D1S507、D17S831、D13S268，HEX標(biāo)記的D1S243、D17S938、D16S505。

1.3 PCR-CE實驗方法

采用PCR-毛細(xì)管電泳法檢測分析克隆起源，PCR反應(yīng)參照zhao等的報道[4]，最后在ABI 3500測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.4 結(jié)果判斷方法

結(jié)果判讀方法參照zhao等的報道[4]。

2.結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

肝臟標(biāo)本14×8×5cm，切面見5個灰白色腫物（T1-T5），直徑1～2.5cm，病理診斷：5結(jié)節(jié)均為肝細(xì)胞癌，硬化型，Ⅲ級。

2.2 免疫組化結(jié)果

5個結(jié)節(jié)免疫組化染色結(jié)果基本相同，HePar-1（-），Arginse（-），CK7（+），GPC-3（+），HBsAg（+）。

2.3 克隆起源檢測結(jié)果

通過上述方法對HCC的5個結(jié)節(jié)（T1-T5）進(jìn)行克隆起源檢測，結(jié)果為：與正常組織（N）相比，腫瘤組織在10個微衛(wèi)星位點(diǎn)處存在缺失（圖1）；5個結(jié)節(jié)之間進(jìn)行比較，結(jié)節(jié)T2和另外4個結(jié)節(jié)均檢出了3個或以上的等位基因缺失，提示結(jié)節(jié)T2與其他4個結(jié)節(jié)為不同克隆來源，結(jié)節(jié)T1,T3-T4之間出現(xiàn)了≤2個等位基因缺失，提示該4個結(jié)節(jié)為相同克隆來源。

3.討論

一般認(rèn)為多結(jié)節(jié)HCC的發(fā)生主要有3種可能，第一種是肝內(nèi)種植轉(zhuǎn)移（intrahepatic metastasis，IM型），與原發(fā)腫瘤為相同克隆來源，即克隆起源；第二種是不同部位的肝細(xì)胞在慢性肝炎或肝硬化背景下，因持續(xù)受到HBV/HCV感染刺激，形成新的腫瘤（multicentric occurrence，MO型），與原發(fā)腫瘤為不克隆來源，即多克隆起源[3]；第三種為以上兩種情況兼有之。

克隆起源模式難以通過臨床表現(xiàn)和病理的組織形態(tài)學(xué)判別，即便是在同一個患者中也可能同時存在IM和MO，通過PCR-毛細(xì)管電泳法檢測腫瘤樣本各結(jié)節(jié)中的10個微衛(wèi)星位點(diǎn)的長度，能夠揭示腫瘤細(xì)胞克隆起源的特征[5]。本例中與正常組織相比，5個腫瘤在10個位點(diǎn)中都有缺失，證明在此微衛(wèi)星區(qū)域很有可能存在和腫瘤發(fā)生相關(guān)的抑癌基因。因此對于多結(jié)節(jié)性HCC進(jìn)行克隆起源檢測能夠?qū)ζ渖飳W(xué)特性有更加全面的認(rèn)識。