LMNA基因突變與先天性心臟病患者的關(guān)系研究

林 煒 王涵磊 林志勇 葛捍偉 薛繼陽 樓志凌 趙琦峰

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)簡稱先心病，是一種由多因素導(dǎo)致的疾病，其致病機(jī)制十分復(fù)雜，致病因素主要是環(huán)境因素和基因因素[1]。先天性心臟病是先天性遺傳病最常見的類型，發(fā)生率約為0.6%～1.2%[2]。大約5%～8%的CHD是由于染色體的異常引起的，其中3%的基因缺陷在一級家庭成員中具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險[3]。我國的先心病發(fā)生率呈逐年上升趨勢，每年大約有15萬～20萬的先心病患兒出生[4]。研究CHD的分子機(jī)制，不僅對CHD發(fā)生的機(jī)制和遺傳干預(yù)有重要的理論依據(jù)作用，而且為探索行之有效的疾病篩查和診治技術(shù)預(yù)防CHD的發(fā)生提供新的思路。

LMNA基因是編碼核纖層蛋白，核纖層蛋白的異常會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，根據(jù)臨床特征不同，至今被認(rèn)識的核纖層蛋白病已有10余種，包括Emery-Dreifuss肌營養(yǎng)不良、Hutchinsong-Gilford早衰綜合征(Hutchinsong-Gilford progeria syndrome，HGPS)、擴(kuò)張性心肌病等[5]。LMNA基因突變會引起多種心臟異常，如心肌病、心臟傳導(dǎo)異常等，但與先天性心臟發(fā)育異常的關(guān)系研究未見報道。本研究團(tuán)隊早期發(fā)現(xiàn)1例先天性心臟發(fā)育異常[室間隔缺損(VSD)+房間隔缺損(ASD)]伴HGPS的患者(圖1)，早衰綜合征是罕見的兒童過早衰老性疾病，研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)HGPS病例的遺傳基礎(chǔ)是在LMNA基因的第11個外顯子中G608G發(fā)生了突變[6]。筆者對該患者進(jìn)行高通量外顯子測序和群體比對，發(fā)現(xiàn)其致病基因也是LMNA基因，并發(fā)現(xiàn)了LMNA基因的新突變c.407A>G，蛋白質(zhì)水平突變?yōu)閜.D136G(圖2)；筆者對具體突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)高度保守，同時利用多種軟件預(yù)測都提示該突變?yōu)橹虏⊥蛔?圖3)。已有報道研究人員利用CRISPR基因編輯技術(shù)成功對HGPS突變DNA進(jìn)行定點(diǎn)編輯及修正[7]。本研究通過分析LMNA基因與先天性心臟病的關(guān)系，為未來提早干預(yù)并治療先心病提供可能。

圖1 CHD(VSD+ASD)伴HGPS的患兒

圖2 新發(fā)現(xiàn)的LMNA基因突變

圖3 LMNA基因新突變保守性分析及預(yù)測

編碼核纖層蛋白的LMNA突變可引起一系列表型不同的疾病，本研究擬利用新一代基因測序技術(shù)探討LMNA基因突變與人類先天性心臟發(fā)育異常的關(guān)系，從基因?qū)用嫣剿鰿HD患者的遺傳學(xué)背景，分析LMNA突變在先天性心臟發(fā)育異常中的比例與分布情況。

資料與方法

1.一般資料：選取2016～2017年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院小兒心胸外科所收治的100例CHD患者并隨機(jī)選取100例種族匹配的例行身體檢查的健康兒童作為對照組。CHD組男性62例，女性38例，患兒年齡0.5～14歲，平均年齡2.1±2.7歲。對照組男性60例，女性40例，年齡1～12歲，平均年齡2.4±2.1歲。所有CHD患者均經(jīng)超聲心動圖、心電圖、胸部X線片及心臟手術(shù)確診，排除綜合性先天性心臟病患兒(如Down 綜合征、DiGeorge 綜合征)。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，且患兒或家屬均知情同意并簽字。

2.標(biāo)本采集：患兒均采集空腹外周靜脈血4～5ml至EDTA抗凝采血管中，混勻，將標(biāo)本存放于-80℃冰箱中，待測。

3.制備基因組DNA：用常規(guī)飽和酚-氯仿法提取基因組DNA：①將300～400μl血液加入至1ml細(xì)胞裂解液中，充分顛倒混勻后，8000r/min離心10min至細(xì)胞沉淀較完全；②棄去上清，取1ml細(xì)胞裂解液加入，用槍頭輕輕吹打使細(xì)胞沉淀散開，繼續(xù)8000r/min離心5min；③重復(fù)步驟②直至液體澄清；④棄去上清，分別將STE 300μl、20%SDS 20μl、蛋白酶K(10μg/μl)15μl加入離心管中,充分混勻后置于50℃水浴鍋中12h；⑤12h后從水浴鍋中取出離心管，取100μl飽和NaCl溶液(6mol/L)加入，輕輕晃動可見白色沉淀析出，繼續(xù)冰浴10min至沉淀完全析出，4℃環(huán)境下5000r/min離心10min；⑥取出上清液至新的離心管中，在通風(fēng)櫥中取等量體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)加入， 5000r/min離心10min，取上清后加入3倍體積冷乙醇，輕輕顛倒搖晃，有白色絮狀DNA沉淀析出；⑦4℃環(huán)境下5000r/min離心10min，棄去冷乙醇，可見離心管底有塊狀DNA沉淀，將離心管倒置于濾紙上使水分自然晾干；⑧加入200μl TE Buffer，并利用紫外分光光度計測定所得DNA濃度，4℃冰箱中保存。

4.引物設(shè)計LMNA：LMNA基因序列來自GenBank(NC_000001.11)。利用Primier 5.0軟件設(shè)計1～12號外顯子的PCR引物用于擴(kuò)增目的片段及測序，引物序列見表1。

5.LMNA基因1～12號外顯子PCR反應(yīng)體系：從離心管中根據(jù)所測濃度取出模板DNA約20ng，加入正向與反向引物(10pmol/L)各1μl，2×PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)10μl，補(bǔ)雙蒸水至20μl。其中，PCR 的發(fā)生條件如下: 預(yù)變性環(huán)節(jié)，溫度95℃，時間5min; 變性環(huán)節(jié)，溫度95℃，時間30s; 退火環(huán)節(jié)，溫度范圍55℃，時間60s; 延伸環(huán)節(jié)，溫度72℃，時間30s; 終延伸環(huán)節(jié)，溫度72℃，時間5min。共35個循環(huán)。

表1 LMNA基因1～12號外顯子引物序列

6.基因測序： 將PCR產(chǎn)物回收送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司，以PCR上游引物為測序引物，用ABI 3730xl 自動測序儀進(jìn)行測序，使用序列分析軟件SnapGene分析測序結(jié)果并將所測序列與GenBank 中的已知序列進(jìn)行比來識別基因變異。

結(jié) 果

1.PCR結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物并與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker比對，各PCR產(chǎn)物與設(shè)計的各片段大小基本符合。

2.DNA測序結(jié)果：在CHD患者組中的LMNA基因中均未發(fā)現(xiàn)突變。

討 論

LMNA基因位于1q21.2～q21.3，基因組序列長度56.7kb，其中編碼區(qū)域長度約為24kb，共編碼12個外顯子。LMNA基因轉(zhuǎn)錄時，10號外顯子會發(fā)生選擇性剪切，此時會有兩種不同的mRNAs，分別編譯兩種不同的蛋白，即prelamin A和lamin C[8]。prelamin A的C末端是“CAAX”模序，經(jīng)金屬蛋白酶Zmpste24、肽鏈內(nèi)切酶2、異戊烯半胱氨酸羧基端甲基轉(zhuǎn)移酶作用后轉(zhuǎn)化為lamin A[9]。lamin C和lamin A的N末端有相同的566個氨基酸殘基，由LMNA基因編碼的這兩種主要產(chǎn)物lamin A/C 屬于核膜中間絲蛋白，其作用在于維持細(xì)胞核膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)和功能，是核膜中主要的骨架蛋白，它在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因組的空間定位中發(fā)揮作用并能決定細(xì)胞核的大小和形狀[10,11]。越來越多的證據(jù)表明，在DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化和凋亡中l(wèi)amin A/C也參與并發(fā)揮著重要的作用[12]。有許多研究已經(jīng)明確了LMNA基因的400多種突變，可表達(dá)20多種不同的表現(xiàn)型，與心肌病相關(guān)位點(diǎn)就多達(dá)100多個，導(dǎo)致各種不同類型的心肌病[13]。LMNA基因突變導(dǎo)致的擴(kuò)張性心肌病特征為心腔大、室壁薄、常伴有心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病、發(fā)病早、預(yù)后差[14]。筆者前期發(fā)現(xiàn)的1例LMNA基因突變國際上尚無報道，此病例患兒表現(xiàn)為早老癥，涉及心血管、骨骼、肌肉及皮膚脂肪等多種系統(tǒng)和組織異常，并無心肌病的表現(xiàn)，但存在CHD(VSD+ASD)，關(guān)于LMNA基因與CHD的相關(guān)性目前國內(nèi)外尚無研究報道。

本研究分別通過對100例CHD患兒及100例正常體檢兒童進(jìn)行LMNA基因的突變篩查，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何突變，LMNA基因突變與CHD患者之間可能無明顯相關(guān)性?；蛟诘貐^(qū)、人群、遺傳背景中的分布具有不同的特異性，因此要從多地區(qū)、多人群、大樣本的研究中才能明確某一基因在致病過程中發(fā)揮的作用，從根本上解釋發(fā)病機(jī)制。因此，LMNA基因突變是否對CHD具有致病意義尚需要進(jìn)一步的研究。本研究未發(fā)現(xiàn)LMNA基因的致病性突變，筆者認(rèn)為可能與以下幾個因素有關(guān)：①前期發(fā)現(xiàn)的LMNA基因突變伴有其他心臟、神經(jīng)、肌肉、脂肪代謝障礙等病變，而本研究中患者具有這些病變的比例較低；②LMNA基因的突變在先天性心臟病中較為罕見，其突變可能并非是導(dǎo)致先天性心臟病的原因；③研究的樣本數(shù)量還不夠大，后續(xù)如果有更大的樣本量也許能發(fā)現(xiàn)LMNA基因的其他致病性突變。