檳榔芋軟腐病土壤拮抗細菌的篩選

董曉菲 史輝 賴倩玉

摘要：為對檳榔芋軟腐病進行生物防治，從檳榔芋根際土壤分離出53株細菌，經(jīng)離體球莖拮抗篩選，獲得9株對檳榔芋軟腐病具有拮抗效果的細菌。拮抗菌的拮抗機制分析表明，拮抗菌對病原菌的拮抗作用不是由于產(chǎn)生次生抑菌物質(zhì)引起的，這種拮抗方式不會引起病原菌的耐藥性突變，因此更為安全可行。

關(guān)鍵詞：檳榔芋;軟腐病;生物防治;土壤拮抗細菌;拮抗方式

中圖分類號： S436.32 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0135-02

檳榔芋（Colocasia esculenta L.var.cormosus Chang），屬于天南星科芋屬魁芋類。檳榔芋有較高的經(jīng)濟價值，在福建省福鼎地區(qū)大面積種植[1]。軟腐病是檳榔芋最重要的病害之一，該病病原為胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐致病型（Erwinia carotovora subsp. carotovora），屬細菌[2]。此病菌也是主要引起其近緣物種芋頭[3]、魔芋[4-5]軟腐病的主要病菌。近年來發(fā)生危害日益嚴重，給檳榔芋產(chǎn)業(yè)造成了嚴重威脅，傳統(tǒng)的防治方法有藥劑防治、合理密植和輪作等[6]，但效果均不理想且存在食品安全和生態(tài)環(huán)境問題。

研究表明，土壤微生態(tài)環(huán)境惡化是造成許多作物重茬病的主要原因。因此，從調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境入手，利用植物根際土壤微生物對檳榔芋病害進行生物防治既可達到病害防治的目的，又可保持生態(tài)平衡，降低化學農(nóng)藥造成的環(huán)境污染，是一種很有研究前景的控制措施。相關(guān)學者對蘋果、番茄、柑橘、草莓、葡萄、辣椒等果蔬的采前、采后病害進行了微生物防治的研究，也取得較好效果。但國內(nèi)外尚無檳榔芋軟腐病生物防治方面的的報道。本研究在實驗室前期已經(jīng)分離鑒定了檳榔芋軟腐病病原菌的基礎上，對檳榔芋根系土壤微生物進行拮抗菌株的篩選，以期為檳榔芋軟腐病的防治和生防菌株的開發(fā)利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 土樣采自福建省福鼎市貫嶺鎮(zhèn)河坑村檳榔芋種植田地。取深度10～15 cm的健康檳榔芋植株根際土壤200 g帶回實驗室，備用。檳榔芋軟腐病病原菌為筆者課題組實驗室前期分離并鑒定的1株軟腐病病原菌（菌株編號141108）。

1.1.2 試劑 NA培養(yǎng)基，其他藥品均為國藥分析純。

1.1.3 儀器 微量移液器，法國吉爾森Pipetman系列;渦旋振蕩器，德國IKAMS3 digital;智能生化培養(yǎng)箱，上海齊欣 KLH-250FD;恒溫搖床，上海南榮NRY2102C;超凈工作臺，蘇州凈化SW-CJ-2D型;自動高壓滅菌器，美國致微GR60DA等。

1.2 方法

1.2.1 根系土壤中細菌的分離 參考方中達的方法[7]，在NA培養(yǎng)基平板上分離純化，根據(jù)平板上長出菌落的形態(tài)、顏色、透明度等性狀挑取不同單菌落，劃線純化后接斜面4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 拮抗菌的離體球莖篩選 參考陳嬌梅等的方法[8]略有改動。將根系土壤中分離的細菌和軟腐病病原菌分別接種于NA液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)8 h備用。選取健康檳榔芋球莖，洗凈并風干后，切取大小為長 5.0 cm、寬3.0 cm、厚0.5～0.7 cm的組織塊，75%乙醇消毒1 min后使用0.1%氯化汞溶液消毒10 min，蒸餾水蕩洗3次，將處理好的組織塊置于放有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中備用。將待測拮抗菌液和軟腐病病原菌液按體積比1 ∶ 1混合。用無菌刀和鑷子在處理好的組織塊中央劃1個長3.0 cm、寬1.0 cm、深0.2～0.3 cm的十字，接種5 μL混合菌液于檳榔芋組織塊十字中央，以無菌水接種作為陰性對照，以軟腐病病原菌和無菌水體積比1 ∶ 1混合接種作為陽性對照，置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，觀察接種部位癥狀并拍照記錄。以上每個處理設置5個重復。

1.2.3 拮抗機制的初步分析 平板拮抗試驗參考龍超安的方法[9]略有改動。將100 μL的病原菌菌液（約1.0×109 CFU/mL）涂布于NA瓊脂平板上，將直徑為5 mm浸有拮抗細菌菌液（約1.0×109 CFU/mL）的濾紙片等距離放置在平板上，每個平板放置5個濾紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察抑菌圈，每個處理重復5次。菌懸液和無菌濾液拮抗試驗分別參考谷會等的方法[10-11]。37 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察抑菌圈，每個處理重復5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系土壤中細菌的分離

采用平板稀釋法從健康檳榔芋根際土壤共分離出53株細菌。編號：N01～N53。

2.2 拮抗菌的離體球莖篩選

接有待測候選拮抗細菌與致病菌混合菌液的檳榔芋組織塊，4～5 d后芋塊出現(xiàn)不同程度的變色，7 d后芋塊出現(xiàn)不同程度的軟腐;其中接種待測菌株N05、N07、N26、N41、N48、N50與致病菌混合菌液的檳榔芋組織塊未發(fā)病，接種N06、N11、N32和致病菌混合菌液的檳榔芋組織塊僅十字一側(cè)出現(xiàn)輕微的軟腐，無特殊氣味出現(xiàn)。其他待測菌株以及接種軟腐病病原菌的陽性對照組，5 d后芋塊出現(xiàn)輕微變色，7 d后芋塊腐爛，并散出腐爛臭味。注射無菌水的陰性對照組未發(fā)病（圖1）。離體球莖防效測定結(jié)果表明，細菌N05、N07、N26、N41、N48、N50對軟腐病病原菌具有明顯的拮抗作用，細菌N06、N11、N32對軟腐病病原菌致病力具有一定減輕作用。

2.3 拮抗機制的初步分析

2.3.1 平板拮抗試驗 對9株有拮抗效果的細菌進行平板拮抗試驗，只有菌株N26濾紙周圍產(chǎn)生抑菌圈，抑菌圈大小為0.5～1.5 mm（圖2），其他均無抑菌圈，說明在平板上對病原菌沒有抑菌效應的細菌不一定沒有生防效果。

2.3.2 菌懸液和無菌濾液拮抗試驗 為確定拮抗菌的拮抗作用是菌體自身還是其產(chǎn)生的次生抑菌物質(zhì)引起的，分別將N26菌株的菌懸液和無菌濾液對軟腐病病原菌做平板拮抗試驗。發(fā)現(xiàn)菌株N26的菌懸液對軟腐病病原菌產(chǎn)生抑菌圈（圖3-A）;菌株N26的無菌濾液對軟腐病病原菌不產(chǎn)生抑菌圈（圖3-B），說明N26對軟腐病病原菌的拮抗作用不是因為其產(chǎn)生的次生抑菌物質(zhì)引起的，而是由菌體自身引起。

3 結(jié)論

本試驗從福建省福鼎市檳榔芋根際土壤分離出53株細菌，經(jīng)離體球莖拮抗篩選，獲得9株對檳榔芋軟腐病具有拮抗效果的細菌，其中拮抗效果較好的細菌6株（N05、N07、N26、N41、N48、N50），能夠減輕植物發(fā)病程度的細菌3株（N06、N11、N32）。平板拮抗試驗結(jié)果表明，此次篩選到的拮抗細菌對病原菌的拮抗作用不是由于產(chǎn)生次生抑菌物質(zhì)引起的，而是其他方式，如競爭作用、抗生作用、重寄生作用、溶菌作用等引起的拮抗效應，其拮抗機制及檳榔芋活體生防效果有待進一步研究闡明。本次試驗篩選到的拮抗菌對軟腐病病原菌的拮抗方式不會引起病原菌的耐藥性突變，因此更為安全可行。

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