豬毛菜屬3種不同光合型物種的生長(zhǎng)適應(yīng)特征比較

周文菲,劉芙蓉,姚甄業(yè),龔春梅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

干旱缺水是中國(guó)西北荒漠地區(qū)尤為突出的生態(tài)問(wèn)題[1]，也是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和限制植物分布的重要因素[2]。植物光合作用對(duì)環(huán)境因子的變化高度敏感，因此植物受到干旱脅迫時(shí)表現(xiàn)出由氣孔限制或非氣孔限制包括光合結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、光合關(guān)鍵酶等活性下降所致[3]的凈光合速率下降[4]。此時(shí)C3植物會(huì)通過(guò)關(guān)閉氣孔的方式來(lái)保持植物體內(nèi)的水分，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CO2吸收受阻，促進(jìn)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase, Rubisco)與氧氣結(jié)合，使光呼吸加強(qiáng)，而這一提高光呼吸或者降低CO2濃度的氣孔限制會(huì)誘導(dǎo)C4光合的出現(xiàn)[5]。C4植物更適應(yīng)水分脅迫和高溫等逆境[6]而獲得比C3植物更高的光合速率[7]?？磥?lái)干旱引起的氣孔和非氣孔限制促進(jìn)了C4光合的發(fā)生，是C4途徑進(jìn)化的外部動(dòng)力和環(huán)境因素。隨著解剖結(jié)構(gòu)和酶活生理研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明隨干旱加劇首先要求解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生更利于C4光合進(jìn)行的變化[8-11]，隨后C4關(guān)鍵酶活性相應(yīng)增強(qiáng)。C3植物發(fā)展出的C4途徑是環(huán)境調(diào)控的產(chǎn)物，是對(duì)逆境的適應(yīng)性進(jìn)化結(jié)果，研究干旱地區(qū)植被的光合途徑演化有利于對(duì)干旱地區(qū)植被的適應(yīng)性機(jī)理進(jìn)行深入剖析[12]。

C3、C3-C4和C4植物的生長(zhǎng)適應(yīng)性是光合途徑進(jìn)化的直觀表現(xiàn)，因而對(duì)光合適應(yīng)性的研究開(kāi)始受到關(guān)注，樸河春等[13-14]對(duì)C3和C4植物的土壤的營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行探究，陳宇琪等[15]對(duì)C3和C4植物種子的出苗和幼苗的生長(zhǎng)等進(jìn)行研究，王玉魁[16]對(duì)不同光合型物種的抗旱生理進(jìn)行研究，但這些研究還不夠全面系統(tǒng)深入。對(duì)干旱地區(qū)具有不同光合型的同屬物種進(jìn)行生長(zhǎng)適應(yīng)性研究非常有必要，這為完善C4光合進(jìn)化理論提供了生理生態(tài)特征變化證據(jù)。豬毛菜屬(Salsola)是藜科(Chenopodiaceae)中較為進(jìn)化的螺胚亞科中的豬毛菜族，是該族中的原始屬[17]。目前對(duì)豬毛菜屬植物在種子生理、養(yǎng)分條件、光合指標(biāo)等多個(gè)方面進(jìn)行了環(huán)境適應(yīng)性研究[18-21]，包括對(duì)適應(yīng)鹽堿生境的先鋒植物費(fèi)爾干豬毛菜(Salsolaferganica)等的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值研究[22]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展和本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬毛菜屬植物中存在著不同的光合型[23-26]，如蒿葉豬毛菜(S.abrotanoides)和天山豬毛菜(S.junatovii)為C3光合型，松葉豬毛菜(S.laricifolia)和白枝豬毛菜(S.arbusculiformis)為C3-C4中間光合型，木本豬毛菜(S.arbuscula)和東方豬毛菜(S.orientalis)為C4光合型，這些植物多生活在干旱荒漠及鹽堿土地區(qū)，逐漸形成了適應(yīng)干旱的形態(tài)特征和生理機(jī)制。因此豬毛菜屬植物為研究不同光合型荒漠植物適應(yīng)干旱環(huán)境的策略提供了理想材料，對(duì)促進(jìn)荒漠植被恢復(fù)、改善生態(tài)環(huán)境具有重要的生態(tài)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。鑒于對(duì)荒漠生境不同光合型植物的抗逆生長(zhǎng)適應(yīng)特征還缺乏更全面深入的比較研究，而結(jié)合C4進(jìn)化對(duì)豬毛菜屬植物進(jìn)行生長(zhǎng)適應(yīng)性的研究有必要進(jìn)一步完善。

本研究利用DNA條形碼技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，選擇豬毛菜屬具有各自地理分布的3種不同光合型木本類(lèi)豬毛菜(C3蒿葉豬毛菜、C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜)作為研究對(duì)象，測(cè)定其葉和種子形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、土壤和植物營(yíng)養(yǎng)(C、N、P)、干旱響應(yīng)指標(biāo)[丙二醛(malondialdehyde,MDA)、可溶性糖(soluble sugar)、脯氨酸(proline)]，并進(jìn)行主成分分析，通過(guò)比較不同光合型植物在各自生境干旱脅迫下的生理響應(yīng)，以期為更好理解C4進(jìn)化提供生理生態(tài)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以2016年采集的西北荒漠廣泛分布的C3型蒿葉豬毛菜、C3-C4中間型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜為研究對(duì)象，采集上述豬毛菜鮮葉樣品液氮速凍帶回至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存進(jìn)行生理生態(tài)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。采樣同時(shí)收集的3個(gè)物種所在的自然保護(hù)區(qū)生境概況如表1所示，隨著光合型從C3經(jīng)由C3-C4向C4過(guò)渡3個(gè)物種的生境年降水量依次減少，干旱程度加劇。

表1 豬毛菜屬C3、C3-C4和C4光合型物種采集地的生境概況Table 1 The habitat profile of the C3, C3-C4 and C4 species of Salsola genus

1.2 試驗(yàn)方法

條形碼基因rps16-trnQ參考Schussler等[26]的方法進(jìn)行測(cè)定，采用SDS(sodium dodecyl sulfate)法提取植物DNA，參考Schussler等[26]的方法設(shè)計(jì)條形碼基因rps16-trnQ的引物并進(jìn)行PCR反應(yīng)，送至擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序獲得序列，結(jié)合NCBI(national center for biotechnology information)下載序列，并利用Mega構(gòu)建NJ(neighbor-joining)進(jìn)化樹(shù),采用戊二醛固定液對(duì)葉片解剖結(jié)構(gòu)固定后用半薄切片機(jī)進(jìn)行切片分析[26]，采用體式顯微鏡(Nikon SMZ 25)進(jìn)行拍照獲得種子形態(tài)，種子重量在萬(wàn)分之一天平上進(jìn)行測(cè)定。

采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量[27]，稱(chēng)取0.1 g植物樣品，加入20%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)研磨沖洗并定容至2.5 mL，離心后取上清液放入離心管，再加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)，混勻后在100 ℃水浴煮10 min，離心后取上清液測(cè)定450、532和600 nm處的吸光值；采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量[28]，稱(chēng)取0.1 g植物樣品，定容到7 mL水中，吸取200 μL提取液，加入800 μL蒸餾水和5 mL蒽酮試劑，在沸水浴中煮沸10 min，620 nm處測(cè)定吸光度值；采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量[27]，稱(chēng)取0.1 g植物樣品，用3 mL磺基水楊酸溶液，在沸水中提取10 min，吸取2 mL提取液，加入2 mL 冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，在沸水浴中加熱30 min，冷卻后加入4 mL 甲苯，搖蕩30 s，取上清液至10 mL離心管中，520 nm處測(cè)吸光度值。

土壤樣品過(guò)0.180 mm篩子、植物葉片過(guò)0.250 mm篩子，以備用于對(duì)碳氮磷含量的分析。采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定葉片和土壤有機(jī)碳含量[29]，稱(chēng)取0.02 g左右的葉樣和0.5 g左右的土樣進(jìn)行測(cè)定；采用半微量凱氏定氮法測(cè)定葉片和土壤全氮含量[30]，稱(chēng)取0.2 g左右的葉樣和1 g左右的土樣消煮后測(cè)定；采用鉬銻抗比色法測(cè)定葉片和土壤全磷含量[31]，稱(chēng)取0.2 g左右的葉樣和0.7 g左右的土樣消煮后進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，利用ImageJ2x計(jì)算葉片和種子的直徑和面積等指標(biāo)，土壤碳氮磷比值通過(guò)土壤養(yǎng)分測(cè)定的數(shù)據(jù)計(jì)算化學(xué)計(jì)量比。采用GraphPad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，利用SPSS 17.0和RStuido軟件進(jìn)行主成分分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于DNA條形碼的豬毛菜屬種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

DNA條形碼技術(shù)是利用一段具有足夠變異的標(biāo)準(zhǔn)化短基因?qū)ξ锓N進(jìn)行鑒定[32]，分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)是通過(guò)比較生物分子序列間的關(guān)系而建立的，可以表示各個(gè)物種間的進(jìn)化關(guān)系。植物DNA條形碼技術(shù)有多種可供選擇的基因，本研究利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和試驗(yàn)獲得的rps16-trnQ序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示C3蒿葉豬毛菜為原始祖先，繼而分別進(jìn)化出C3-C4型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜(圖1)。為豬毛菜屬不同光合型植物的進(jìn)化方向和親緣關(guān)系提供可靠證據(jù)。

圖1 基于rps16-trnQ構(gòu)建的豬毛菜屬不同光合型物種的進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree analysis based on nucleotide of rps16-trnQ

2.2 豬毛菜屬3種光合型物種形態(tài)結(jié)構(gòu)適應(yīng)性比較

2.2.1葉片解剖結(jié)構(gòu)的比較 豬毛菜屬植物葉片多呈圓柱形，因而可對(duì)葉片直徑進(jìn)行測(cè)量從而反映葉片大小(圖2a～c)。C4東方豬毛菜的葉片直徑顯著低于C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜的葉片直徑相較于C3蒿葉豬毛菜有變小的趨勢(shì)(圖2d)。C3型豬毛菜葉片橫切面的最外層為表皮細(xì)胞，葉肉細(xì)胞居于中間，向內(nèi)是發(fā)達(dá)的貯水薄壁組織細(xì)胞，維管束分布在貯水組織中，中央的維管束較大，維管束鞘不發(fā)達(dá)；C3-C4松葉豬毛菜與C3蒿葉豬毛菜相比，其葉肉細(xì)胞的面積無(wú)顯著差異，但有減少的趨勢(shì)，出現(xiàn)具備部分功能的不完全花環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域，即由葉肉細(xì)胞和不連續(xù)的維管束鞘細(xì)胞組成(圖2e)；C4型豬毛菜具有由葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞組成的典型C4“花環(huán)結(jié)構(gòu)”。另外，相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物具有較大的貯水組織，且C4植物的貯水組織面積大于C3-C4植物(圖2f)；C3-C4植物和C4植物的柵欄組織更為發(fā)達(dá)。

2.2.2種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 豬毛菜屬3種光合型豬毛菜種子均為螺旋胚形(圖3a～i)，不同點(diǎn)在于種子外層覆蓋物和種子大小，相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物種子外層覆蓋物更為緊密；C3-C4植物的種子大小和重量都明顯大于C3植物和C4植物(圖3j,k)。圖3a～c分別顯示C3型蒿葉豬毛菜的上下兩面和剝?nèi)ジ采w物后的種子形態(tài)；圖3d～f分別顯示C3-C4植物松葉豬毛菜的上下兩面和剝?nèi)ジ采w物后的種子形態(tài)；圖3g～i分別顯示C4植物東方豬毛菜的上下兩面以及剝?nèi)ジ采w物后的種子形態(tài)。

2.3 豬毛菜屬3種光合型物種生理水平適應(yīng)性比較

C4型東方豬毛菜的丙二醛含量略高于C3-C4型松葉豬毛菜，但都明顯低于C3型蒿葉豬毛菜，說(shuō)明C3-C4型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜在干旱環(huán)境下的膜穩(wěn)定性都較高(圖4a)；C3-C4型松葉豬毛菜的可溶性糖含量低于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜(圖4b)；隨著光合型向C4轉(zhuǎn)變，脯氨酸含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)(圖4c)。推測(cè)可溶性糖在C4東方豬毛菜的滲透調(diào)節(jié)中起重要作用，脯氨酸在C3-C4松葉豬毛菜滲透調(diào)節(jié)中起一定作用，而可溶性糖和脯氨酸在C3型蒿葉豬毛菜通過(guò)滲透調(diào)節(jié)的抗旱適應(yīng)性中均起一定作用。

2.4 豬毛菜屬3種光合型物種生境貧瘠適應(yīng)性比較

2.4.1植物葉生態(tài)化學(xué)計(jì)量特征 C3-C4松葉豬毛菜的碳含量低于C3蒿葉豬毛菜，但二者都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于C4東方豬毛菜(圖5a)；C3植物的氮含量顯著高于C3-C4植物，但是兩者都顯著低于C4植物(圖5b)，這與磷含量在3種光合型豬毛菜中的趨勢(shì)類(lèi)似(圖5c)。C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的C/N和C/P無(wú)顯著差異，但是都顯著低于C3-C4松葉豬毛菜(圖5d,e)；這說(shuō)明C3-C4松葉豬毛菜的N、P元素利用率最高，即同化單位N或者P元素固定的碳含量最高。再結(jié)合3種光合型植物的碳含量發(fā)現(xiàn)不同光合型豬毛菜采用不同策略來(lái)增強(qiáng)固碳量，C3-C4松葉豬毛菜采用的是增強(qiáng)N、P元素的利用率來(lái)增加植物的固碳量，而C4東方豬毛菜通過(guò)增加N、P元素的含量來(lái)增加植物的固碳量。從C3到C3-C4再到C4豬毛菜，葉N/P呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖5f)，表明這3種光合型豬毛菜體內(nèi)P起限制作用，到C4東方豬毛菜，這種限制作用逐漸減小，暗示C4進(jìn)化過(guò)程中低磷脅迫越來(lái)越弱。同時(shí)N/P下降也反映出植物可以降低對(duì)氮的需求，以便更能適應(yīng)貧瘠的環(huán)境從而提高耐瘠薄性。

圖2 豬毛菜屬3種不同光合型物種的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征比較Fig.2 The leaf anatomical structure and relative quantitative index of Salsola genus 不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences (P<0.05). The same below.

圖3 豬毛菜屬不同光合型物種的種子形態(tài)差異以及直徑和百粒重的比較Fig.3 The variation of seeds morphology, 100-seed weight and diameter among 3 photosynthetic types of Salsola genus

2.4.2土壤生態(tài)化學(xué)計(jì)量特征 C3蒿葉豬毛菜生境中的土壤碳、氮含量顯著高于C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間差異不大(圖6a,b)，說(shuō)明C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境中土壤的營(yíng)養(yǎng)元素相對(duì)匱乏。C3-C4松葉豬毛菜生境中的土壤磷含量顯著高于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間差異不大(圖6c)。C3-C4松葉豬毛菜的土壤C/N略高于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，但不顯著，C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間的C/N差異不大(圖6d)，有效氮含量略低于全國(guó)平均水平。C4東方豬毛菜的土壤C/P和土壤N/P略高于C3-C4松葉豬毛菜，但是它們的土壤C/P和土壤N/P都顯著低于C3蒿葉豬毛菜(圖6e,f)，豬毛菜生境土壤C/P含量明顯低于全國(guó)平均水平，且C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的土壤有效磷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于C3蒿葉豬毛菜。

圖4 豬毛菜屬不同光合型物種的抗旱性差異比較分析Fig.4 The physiological index among the 3 photosynthetic types of Salsola genus

圖5 豬毛菜屬不同光合型物種葉營(yíng)養(yǎng)元素及比值變化Fig.5 The content of leaf nutrient elements and its ratio of Salsola genus

2.5 主成分分析

逆境下植物的生長(zhǎng)適應(yīng)性由多種生理生態(tài)指標(biāo)共同塑造，而這些指標(biāo)之間具有一定的相關(guān)性，為探究這些相關(guān)指標(biāo)對(duì)豬毛菜適旱生長(zhǎng)的貢獻(xiàn)率，本試驗(yàn)采用主成分分析法，對(duì)干旱驅(qū)動(dòng)的不同光合型豬毛菜的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，為C4進(jìn)化的表觀生長(zhǎng)影響因子進(jìn)行歸類(lèi)并評(píng)價(jià)。

通過(guò)主成分分析，提取2個(gè)主成分，在第一主成分軸上，C3-C4植物松葉豬毛菜和C4植物東方豬毛菜得分較高。在第二主成分軸上，C3植物蒿葉豬毛菜得分較高(圖7)。第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為51.079%，在這一主成分中，葉片C、N、P含量和葉片C/N、C/P、種子直徑和百粒重、可溶性糖含量和土壤C/N、土壤P含量等指標(biāo)具有較高的載荷值，對(duì)松葉豬毛菜貢獻(xiàn)較大(表2和圖7)；第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為48.921%，這一主成分中，葉片C、N和P以及貯水組織面積、維管束鞘面積、可溶性糖含量、降水量等具有較高的載荷值，對(duì)東方豬毛菜貢獻(xiàn)較大(表2)。

圖6 豬毛菜屬不同光合型物種生境土壤營(yíng)養(yǎng)元素及比值變化Fig.6 The content of soil nutrient elements and its ratio among 3 photosynthetic types of Salsola genus

項(xiàng)目Item主成分Principalcomponents(PC)PC1PC2項(xiàng)目Item主成分Principalcomponents(PC)PC1PC2葉片C/PLeafC/P0.998-脯氨酸含量Prolinecontent0.2620.965土壤P含量SoilPcontent0.990-0.140降水量Precipitation0.2760.961葉片C/NLeafC/N0.988-0.156土壤C含量SoilCcontent-0.3120.950種子百粒重100-seedsweight0.978-0.210土壤N含量SoilNcontent-0.3500.937葉片N含量LeafNcontent-0.966-0.258維管束鞘面積Areaofbundle-sheathcell-0.436-0.900種子直徑Seeddiameter0.964-0.268土壤C/PSoilC/P-0.5060.863可溶性糖含量Solublesugarcontent-0.942-0.334土壤N/PSoilN/P-0.5060.862葉片P含量LeafPcontent-0.906-0.423葉片直徑Leafdiameter0.5090.861土壤C/NSoilC/N0.865-0.502MDA含量MDAcontent-0.6890.724葉片C含量LeafCcontent-0.828-0.561貢獻(xiàn)率Contributionrate(%)51.07948.921葉片N/PLeafN/P-1.000累積貢獻(xiàn)率Cumulativecontributionrate(%)51.079100.000貯水組織面積Areaofwaterstoragecell-0.112-0.994

從載荷圖(圖7)可知，在第一主成分上能夠分開(kāi)C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，在第二主成分上能夠分開(kāi)C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜。C3蒿葉豬毛菜的土壤C、N含量和土壤N/P、C/P、丙二醛和脯氨酸含量較高；C3-C4松葉豬毛菜的種子直徑和百粒重、葉片C/N、C/P較高；C4東方豬毛菜的維管束鞘面積和貯水組織面積、葉片C、N、P含量、可溶性糖含量較高。

圖7 豬毛菜屬不同光合型物種多種指標(biāo)的載荷圖Fig.7 Load map of various indexes among 3 photosynthetic types Salsola genus

3 討論

至此，已對(duì)藜科豬毛菜屬3種不同光合型植物應(yīng)對(duì)干旱貧瘠的生長(zhǎng)適應(yīng)性做了初步比較。

首先確立不同光合型豬毛菜的親緣關(guān)系和C4演化方向。已有研究對(duì)菊科黃頂菊屬(Flaveria)不同光合型植物的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黃頂菊屬C3植物位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的最底部，之后進(jìn)化出C3-C4和C4光合途徑[33]。本研究利用DNA條形碼對(duì)不同光合型豬毛菜植物進(jìn)行構(gòu)樹(shù)聚類(lèi)研究，發(fā)現(xiàn)C3-C4型豬毛菜與C4型豬毛菜也是由C3型豬毛菜演化而來(lái)，這與不同光合型黃頂菊屬植物的進(jìn)化總體方向一致[34]，明確了不同光合型豬毛菜的親緣關(guān)系和C4進(jìn)化方向。

不同光合型豬毛菜應(yīng)對(duì)干旱脅迫產(chǎn)生葉和種子的形態(tài)結(jié)構(gòu)不同。葉片可以進(jìn)行光合作用和蒸騰作用等多種生命活動(dòng)，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在行使生理功能的過(guò)程中葉片與環(huán)境之間有著緊密的關(guān)系，因而為了適應(yīng)環(huán)境的變化，植物葉片會(huì)在外部形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面發(fā)生一系列的適應(yīng)性變化。豬毛菜屬3個(gè)種從C3向C4方向過(guò)渡，外部形態(tài)上柱狀葉趨于細(xì)短，細(xì)小的葉型可以減少水分蒸發(fā)面積而更耐旱[4]，表明豬毛菜屬植物在向C4進(jìn)化過(guò)程中其葉片外部形態(tài)越來(lái)越適應(yīng)干旱環(huán)境。解剖結(jié)構(gòu)上相較于C3種，C3-C4種和C4種的柵欄組織和貯水組織更為發(fā)達(dá)。柵欄組織/海綿組織越大，即柵欄組織越發(fā)達(dá)，植物越耐旱；貯水組織越發(fā)達(dá)，植物越耐旱[35-36]。這便是豬毛菜C4植物更耐旱的原因[37]。同時(shí)豬毛菜C4種葉片具有典型的豬毛菜型“花環(huán)”結(jié)構(gòu)，即由外層整齊排列的葉肉細(xì)胞和內(nèi)層較發(fā)達(dá)的維管束鞘細(xì)胞組成，旨在通過(guò)四碳化合物從葉肉細(xì)胞向維管束鞘的運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)二氧化碳在維管束鞘細(xì)胞內(nèi)的再固定，為高光效光合作用提供了快速產(chǎn)生和運(yùn)輸有機(jī)產(chǎn)物的物質(zhì)條件和合理結(jié)構(gòu)。

干旱條件下植物的生長(zhǎng)環(huán)境非常嚴(yán)酷，因此，為適應(yīng)這種嚴(yán)酷的條件，植物具有其特殊的適應(yīng)機(jī)制，其中種子繁殖便是荒漠植物產(chǎn)生的一種適應(yīng)機(jī)制[38]。從種子自身萌發(fā)特性而言，種子大小影響植物生長(zhǎng)和存活：較大的種子萌發(fā)緩慢但萌發(fā)后生存力強(qiáng)，自身競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)；較小種子萌發(fā)較快但萌發(fā)后生存力較弱，但種子大小與種子數(shù)量和種子擴(kuò)散分布成反比，具有較小種子的植物，其種子在數(shù)量上一般居多，采取的是機(jī)會(huì)主義生存策略[39]。C3-C4松葉豬毛菜的種子無(wú)論在形態(tài)上還是重量上都明顯大于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，其采用增強(qiáng)種子自身競(jìng)爭(zhēng)力的機(jī)制來(lái)適應(yīng)環(huán)境，而C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜則采取在種子傳播上占據(jù)優(yōu)勢(shì)的策略。為了適應(yīng)干旱的環(huán)境，荒漠植物種子表面具有水溶性抑制物質(zhì)，只有在大量降水后，這些抑制物質(zhì)被洗脫掉才能萌發(fā)，以保證形成的幼苗不致因缺水而枯死。從形態(tài)上可以看出來(lái)，豬毛菜種子外有一層覆蓋物，這層覆蓋物可能發(fā)揮著保護(hù)種子免受環(huán)境脅迫、保持種子水分等作用，隨著向C4進(jìn)化，這層覆蓋物越加致密發(fā)達(dá)。

干旱脅迫下植物細(xì)胞膜容易發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛，因此常用葉片的丙二醛含量來(lái)反映植物膜脂過(guò)氧化程度，即丙二醛含量越高，說(shuō)明細(xì)胞膜不穩(wěn)定，則植物的抗旱能力越弱。不同光合型豬毛菜應(yīng)對(duì)干旱脅迫在抗性生理方面表現(xiàn)出差異。干旱脅迫下植物葉片容易遭受氧化脅迫使得膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生丙二醛，但耐旱植物在逆境中產(chǎn)生的丙二醛含量較低[40]，本試驗(yàn)中C4物種產(chǎn)生的丙二醛含量較低。干旱脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)水勢(shì)較低，會(huì)通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)吸收更多的水分以維持植物體正常的生命活動(dòng)，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有可溶性糖和脯氨酸等。本研究結(jié)果中，脯氨酸和可溶性糖在C3蒿葉豬毛菜中的作用均大于C3-C4蒿葉豬毛菜，相較于脯氨酸，可溶性糖在C4東方豬毛菜中發(fā)揮重要的作用。不同植物在干旱脅迫下積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)種類(lèi)存在差異，如無(wú)機(jī)離子在中生植物滲透調(diào)節(jié)中起的作用較小[41]，但在葡萄(Vitisvinifer)植株中卻起著大于可溶性有機(jī)物質(zhì)的作用[42]?？扇苄蕴呛吭谔鸩?Betavulgaris)[43]、豌豆(Pisumsativum)[44]等植物抗旱中發(fā)揮著重要的滲透調(diào)節(jié)作用，但是也有研究指出干旱脅迫下，植物碳同化率降低，可溶性糖含量降低[45]，本試驗(yàn)中相較于脯氨酸，可溶性糖在調(diào)節(jié)C4東方豬毛菜滲透作用的過(guò)程中起著更為重要的作用，在向C4光合過(guò)渡中植物的光合能力逐漸增強(qiáng)，通過(guò)可溶性糖來(lái)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的滲透勢(shì)具有極為便利的物質(zhì)基礎(chǔ)。

植物通過(guò)光合作用吸收大氣中的二氧化碳，通過(guò)葉的蒸騰作用獲取土壤中的水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，驅(qū)動(dòng)陸地生態(tài)系統(tǒng)中水和碳氮磷等元素的生物地化循環(huán)[46]。作為植物的基本營(yíng)養(yǎng)元素，C元素是構(gòu)成植物體最主要的結(jié)構(gòu)元素，而N和P是植物體主要的功能元素，因?yàn)樗鼈兪侵参矬w內(nèi)各種蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)重要的組成元素，C、N、P在植物生長(zhǎng)和各種生理調(diào)節(jié)機(jī)能中關(guān)系密切,且發(fā)揮著重要作用。植物葉片中的C/N、C/P不僅可以反映植物N、P元素的利用率，還反映了植物吸收單元同化C元素的能力。換言之，比值越高，說(shuō)明植物吸收單位N或者P元素同化的C元素越多[47-48]，植物N/P則被用來(lái)評(píng)價(jià)生態(tài)系統(tǒng)中營(yíng)養(yǎng)元素的限制作用。本試驗(yàn)結(jié)果中，C3-C4植物的C/N、C/P中明顯大于C3植物和C4植物，這說(shuō)明C3-C4植物的N、P元素利用率最高，即同化單位N或者P元素固定的C含量最高，再結(jié)合3種光合型植物的碳含量發(fā)現(xiàn)不同光合型豬毛菜采用不同策略來(lái)增強(qiáng)碳積累，C3-C4松葉豬毛菜采用的是增強(qiáng)N、P元素的利用率來(lái)增加植物的碳積累，而C4東方豬毛菜通過(guò)增加N、P元素的含量來(lái)增加植物的碳積累。植物組織中的營(yíng)養(yǎng)元素含量被用來(lái)評(píng)價(jià)生態(tài)系統(tǒng)中營(yíng)養(yǎng)元素限制作用，N/P的化學(xué)計(jì)量比值被用來(lái)評(píng)價(jià)N或P中哪一種更多地起限制生物量產(chǎn)量和物種豐度的作用，一般認(rèn)為，N起限制作用的N/P臨界值為6.7～16.0，而P起限制作用的N/P臨界值為12.5～26.3，低于臨界值表示N起限制作用，高于臨界值表示P起限制作用[49]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，這3種光合型豬毛菜體內(nèi)N/P所處范圍屬于P起限制作用，且隨著向C4進(jìn)化，這種限制作用逐漸減小，有研究表明低磷脅迫能顯著降低葉片相對(duì)含水量和葉綠素含量，同時(shí)，低磷脅迫能顯著降低葉片光合速率和氣孔導(dǎo)度[14]，因而C4進(jìn)化過(guò)程中低磷脅迫越來(lái)越弱。

不同光合型豬毛菜應(yīng)對(duì)貧瘠生境在生態(tài)化學(xué)計(jì)量特征方面表現(xiàn)出差異。結(jié)合所在區(qū)域生境土壤的營(yíng)養(yǎng)元素，能揭示植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的需要和當(dāng)?shù)赝寥赖酿B(yǎng)分供給能力，對(duì)植物與環(huán)境的適應(yīng)與反饋能力都具有十分重要的意義[50]。土壤是植物生存的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要的環(huán)境條件，土壤C、N、P等養(yǎng)分含量是衡量土壤肥沃程度的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中，相較于C3蒿葉豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境中土壤的營(yíng)養(yǎng)元素相對(duì)匱乏。同時(shí)，土壤C/N、C/P和N/P也是確定土壤C、N、P平衡特征的重要參數(shù)，全球和全國(guó)土壤C/N平均水平為14.3和10～12[51]，C3-C4松葉豬毛菜的C/N大于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，但都維持在全國(guó)平均水平附近，土壤有機(jī)層的C/N較低表明土壤有機(jī)層的有效氮含量相對(duì)較高，因此盡管C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境土壤C、N含量較低，但土壤有效氮含量與C3植物相當(dāng)；陸生生態(tài)系統(tǒng)中，生物固氮量隨著土壤中N/P增大而減少，隨土壤中N/P減少而增大[52]，本試驗(yàn)中C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜其生境土壤的生物固氮量明顯大于C3植物；較低的C/P也反映了土壤中有效磷濃度較高，我國(guó)土壤C/P的平均值為61[53]，豬毛菜生境中C/P明顯低于全國(guó)平均水平，從葉片營(yíng)養(yǎng)元素分析中可看出豬毛菜植物受到低磷脅迫，C3-C4較低的土壤C/P也反映了土壤中有效磷濃度較高，松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的土壤有效磷濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于C3植物。這一結(jié)論與豬毛菜葉片存在低磷脅迫且C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜能緩解低磷脅迫相一致。簡(jiǎn)而言之，C3-C4物種松葉豬毛菜生境中土壤C、N含量貧瘠，但土壤P含量豐富且土壤有效P含量較高，葉片C、N、P含量較低，但其葉片P元素利用率較高；C4植物東方豬毛菜生境中土壤C、N含量貧瘠，但土壤有效P含量較高，葉片C、N、P含量較高。表明C3-C4植物松葉豬毛菜和C4植物東方豬毛菜采用不同的策略來(lái)緩解低磷脅迫。

C4進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)因素之一是干旱，其形成受環(huán)境因子以及植物對(duì)環(huán)境的生物和生態(tài)適應(yīng)性差異的影響，通過(guò)對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，在C4進(jìn)化中，主要受兩大類(lèi)因素影響，各因素的方差貢獻(xiàn)率分別為51.079%和48.921%。在第一主成分上能夠分開(kāi)C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，在第二主成分上能夠分開(kāi)C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜。C3植物在第二主成分上具有較高的得分，表明相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物更能適應(yīng)貧瘠的環(huán)境。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)基于 DNA 條形碼對(duì) 3 種光合型豬毛菜的生長(zhǎng)適應(yīng)性包括形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗旱生理和生態(tài)特征進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)，獲得以下主要結(jié)論，為完善C4進(jìn)化理論提供表觀生長(zhǎng)適應(yīng)證據(jù)。

1)C3光合型豬毛菜是原始祖先，C3-C4中間型豬毛菜與C4光合型豬毛菜由C3光合型豬毛菜進(jìn)化而來(lái)；2)與C3光合型蒿葉豬毛菜相比， C3-C4中間型松葉豬毛菜以及C4光合型東方豬毛菜葉從外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)上逐漸形成適應(yīng)干旱的結(jié)構(gòu)特征，且種子的傳播策略也因種子大小不同而發(fā)生變化；3)C4光合型豬毛菜因高光合能力使其具備通過(guò)可溶性糖來(lái)調(diào)節(jié)滲透能力的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而提高抗旱能力；4)C3-C4型豬毛菜是通過(guò)提高氮和磷的利用效率來(lái)增加固碳量，C4光合型豬毛菜是通過(guò)氮和磷含量的增多來(lái)增加固碳量。相較于C3物種蒿葉豬毛菜，C3-C4物種松葉豬毛菜和C4物種東方豬毛菜更能適應(yīng)貧瘠的環(huán)境。