季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子的制備及抗菌性能研究

肖凌寒, 李 娜, 卜聃琳

(1.長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130012;2.長春工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)高等研究院， 吉林 長春 130012)

0 引 言

近年來，由病毒和細菌等微生物引起的健康問題頻頻出現(xiàn)，引起了人們的重視，研發(fā)新型、高效、無二次污染的抗菌材料成為當今研究熱點之一[1-2]。

鹵胺抗菌材料因其抗菌效果優(yōu)異、穩(wěn)定性高、無毒、廉價、可再生等特點，廣泛用于醫(yī)療領(lǐng)域、食品包裝、水凈化系統(tǒng)等方面。鹵胺化合物經(jīng)過水解，N-Cl鍵轉(zhuǎn)變成N-H鍵，釋放出的Cl+具有強氧化性，可以破壞細胞基質(zhì)，從而起到抗菌作用[3-4]。隨后，將其用消毒水(有效成分為NaClO)進行氯化處理，N-H鍵又轉(zhuǎn)變成N-Cl鍵，具有抗菌可再生性。對于鹵胺化合物而言，其與細菌相接觸的面積對抗菌效果起至關(guān)重要的作用。磁性納米粒子因其具有小尺寸、較大比表面積、無毒、可進行磁性回收等特點，廣泛用于抗菌納米復(fù)合材料的制備當中[5-6]。

季銨鹽類抗菌劑，尤其是高分子季銨鹽帶有豐富的正電荷，可以與帶負電荷的細菌相互作用，并破壞細胞質(zhì)膜，導(dǎo)致滲透，從而起到抗菌作用。高分子季銨鹽因具有廣譜、耐熱性好、毒性低等優(yōu)點，已成為抗菌領(lǐng)域的研究熱點[7-8]。

本研究引入了聚乙烯亞胺(PEI)，其富含活性較高的氨基，將其接枝到Fe3O4@SiO2納米粒子表面，并將本研究中合成的3-溴丙基-5,5-二甲基海因接枝到改性納米粒子表面，將PEI季銨化，經(jīng)過氯化處理得到季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子，成功地制備了一種協(xié)同季銨鹽和鹵胺抗菌機理的可回收的抗菌納米復(fù)合材料。對氯化前后樣品進行抗菌測試，探究其抗菌性能及抗菌機理。

1 實驗部分

1.1 材料與設(shè)備

5，5-二甲基海因(98%)、1,3-二溴丙烷(99%)、硅酸四乙酯(>99%，GC)、γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(97%)、聚乙烯亞胺(M=70 000)，上海麥克林生物生化科技有限公司；

氨水(25 wt%～28 wt%)、三氯化鐵(99%)、碳酸鉀、氫氧化鉀，天津光復(fù)精細化工研究所；

乙二醇(AR)、無水乙酸鈉、檸檬酸鈉、甲醇(AR)、無水乙醇(AR)、次氯酸鈉(AR)，北京化工廠。

核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司1H-NMR，AV-400；

透射電子顯微鏡(TEM),日本電子JEM-2000EX；

傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR),美國賽默飛世爾公司Thermo Fisher IS50；

Zeta電位分析儀,美國布魯克海文儀器公司 90Plus Zeta；

振動樣品磁強計(VSM),中國上海懿宏科學(xué)儀器有限公司Lake Shore 7404。

1.2 實驗方法

1.2.1 3-溴丙基-5,5-二甲基海因的合成

按照文獻[9]合成3-溴丙基-5,5-二甲基海因(BHD)，將3.2 g 5,5-二甲基海因(DMH，25 mmol)溶于120 mL丙酮當中，加入10 g無水碳酸鉀(75 mmol)，冷凝回流1 h，再加入2.8 mL 1,3-二溴丙烷(27 mmol)，反應(yīng)70 ℃回流12 h。待反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫后，進行抽濾除去未反應(yīng)的碳酸鉀，收集濾液進行減壓蒸餾而得到白色固體粗產(chǎn)品，再用柱層析法將該固體進行提純(乙醇/環(huán)己烷=1/2-1/1)，最終得到白色固體即為目標化合物，產(chǎn)率為80%。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)：δ(×10-6)= 5.93(s，1H)，3.64(t,J=6.9 Hz,2H)，3.39(t，J=6.7 Hz)，2.22(m，2H)，1.43(s，6H)。

1.2.2 環(huán)氧官能團修飾的Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

首先通過改進的水熱法制備Fe3O4納米粒子[10]。將1.08 g三氯化鐵溶于20 mL乙二醇中，攪拌0.5 h后加入1.8 g無水乙酸鈉再繼續(xù)攪拌1 h，溶液變成澄清黃色，繼續(xù)向上述反應(yīng)加入0.25 g檸檬酸鈉，待其形成均相分散液，轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，200 ℃反應(yīng)10 h。在外加磁場下將磁性納米粒子分離出來，用去離子水和乙醇沖洗后離心，重復(fù)幾次，放入60 ℃真空烘箱中干燥。

通過溶膠-凝膠法制備Fe3O4@SiO2納米粒子[11]。取0.2 g新制備的Fe3O4納米粒子，20 mL蒸餾水，80 mL乙醇，2 mL氨水置于250 mL的三口圓底燒瓶中，機械攪拌30 min，將5 mL硅酸四乙酯加入20 mL乙醇中，然后將混合液逐滴滴加到上述反應(yīng)中，繼續(xù)室溫攪拌12 h。待反應(yīng)結(jié)束，磁性分離出Fe3O4@SiO2納米粒子，用去離子水和乙醇沖洗并離心，重復(fù)幾次，真空干燥。

將0.5 g Fe3O4@SiO2加到0.1 mL γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)和40 mL乙醇的混合液當中，40 ℃回流12 h。用去離子水和乙醇沖洗幾次除去未反應(yīng)的KH560，放入真空烘箱中干燥，記為Fe3O4@SiO2-KH560。

1.2.3 季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

將一定量Fe3O4@SiO2-KH560分散到甲醇當中，按照質(zhì)量比4∶1加入聚乙烯亞胺(PEI)，于3 ℃反應(yīng)7 h。改性納米粒子表面的環(huán)氧官能團與PEI上的伯氨和仲胺基發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，這個過程就是PEI的叔胺化過程。反應(yīng)結(jié)束，用水和乙醇進行沖洗，多反復(fù)幾次，再真空烘干，得到Fe3O4@SiO2-PEI納米粒子。

稱取0.1 g BHD固體，將其溶于50 mL甲醇當中，待升溫至60 ℃再加入0.5 g Fe3O4@SiO2-PEI納米粒子，繼續(xù)反應(yīng)24 h。在這個反應(yīng)過程中，BHD與納米粒子表面PEI的叔胺位進行取代反應(yīng)，即為PEI的季銨化過程。待反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水和乙醇沖洗，放入真空烘箱干燥一夜，得到Fe3O4@SiO2-QPEI納米粒子。

將0.5 g Fe3O4@SiO2-QPEI加入30 mL次氯酸鈉溶液(30 wt%)中，機械攪拌12 h，用水和乙醇沖洗3次，60 ℃真空干燥一夜得到季銨化鹵胺聚合物改性納米粒子，記為Fe3O4@SiO2-QPC。

1.3 有效氯含量的測定

按照硫代硫酸鈉-碘量法滴定，測得有效氯的含量[12]。取一定量Fe3O4@SiO2-QPC抗菌納米粒子于錐形瓶中，加入一定量去離子水、碘化鉀以及淀粉溶液。KI中I-會被納米粒子表面Cl+還原成I2，此時溶液顯藍色。用已知濃度的硫代硫酸鈉標準溶液去滴定上述溶液，其有還原性，會將I2還原成I-，藍色消失即達到滴定終點。重復(fù)3次，進行平行滴定。

有效氯的含量

(1)

式中：N----滴定所消耗的硫代硫酸鈉的當量濃度,N；

V----滴定所消耗的硫代硫酸鈉的體積,L；

W----滴定所使用樣品的質(zhì)量,g。

1.4 抗菌性能測試

選用金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和大腸桿菌(ATCC25922)作為指示菌，用最小抑菌濃度法對粉末樣品進行抗菌性能的表征。先把樣品進行滅菌處理，然后將其配制成一系列的不同梯度的濃度，再把已知濃度的樣品倒至一定量濃度的菌液之中，以37 ℃進行恒溫震蕩培養(yǎng)，通過觀察其渾濁度的變化來判斷細菌是否增殖，當不出現(xiàn)增殖現(xiàn)象的時候，所使用的濃度就是樣品的最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)分析

BHD的1H-NMR譜圖如圖1所示。

圖1 BHD的1H-NMR譜圖

由圖1可以看出，5.93×10-6處為海因環(huán)N-H上的氫原子，3.64×10-6和3.39×10-6處為烷基取代鏈上靠近海因環(huán)一側(cè)和靠近Br一側(cè)-CH2-上的氫原子，2.22×10-6處為烷基鏈最中間-CH2-上的氫原子，1.43×10-6處為海因環(huán)兩個-CH3上的氫原子。該1H-NMR譜圖中的化學(xué)位移、峰面積以及峰型都吻合BHD的化學(xué)結(jié)構(gòu)。說明了目標化合物3-溴丙基-5,5-二甲基海因的成功制備。

2.2 TEM分析

對Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC納米粒子進行形貌分析，其透射電子顯微鏡圖片如圖2所示。

(a) Fe3O4

(b) Fe3O4@SiO2

(c) Fe3O4@SiO2-QPC圖2 TEM圖片

由圖2(a)可以看出，F(xiàn)e3O4出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，直徑約為96 nm。圖2(b)中能夠明顯看出，F(xiàn)e3O4@SiO2具有核殼結(jié)構(gòu)，SiO2殼成功地包覆在Fe3O4核的表面，該納米粒子分散均勻，粒徑大小相對均勻，直徑約為125 nm，外部SiO2殼層厚度約為14.5 nm。圖2(c)可知，F(xiàn)e3O4@SiO2-QPC直徑約為153 nm，其殼外表面粗糙，為聚合物殼層，厚度約為9 nm。

2.3 FT-IR分析

對樣品進行了紅外測試，采用溴化鉀壓片法，KBr為光譜純，結(jié)果如圖3所示。

圖3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC的FT-IR譜圖

由圖3曲線a可以看出，在589 cm-1處是Fe-O的特征吸收峰。曲線b可以看出，除了有Fe-O 特征吸收峰之外，還多出現(xiàn)了3個強峰，在1 100 cm-1和840 cm-1處歸屬于Si-O-Si鍵的對稱和不對稱伸縮振動吸收峰，而在950 cm-1處是Si-OH的伸縮振動峰。這個結(jié)果表明SiO2殼層成功地包覆在核Fe3O4納米粒子的表面。曲線c可以看出，除了以上特征吸收峰外，在1 700 cm-1處出現(xiàn)一個峰，這個峰是海因環(huán)上C=O的特征吸收峰。這個結(jié)果表明BHD成功地接枝到了Fe3O4@SiO2-PEI表面。曲線d可以看出，F(xiàn)e3O4@SiO2-QPC的FT-IR譜圖上，由于氯化作用N-H轉(zhuǎn)變?yōu)镹-Cl，破壞了原來的N-H…O-C氫鍵，原來1 700 cm-1處的C=O偏移到了1 680 cm-1，此結(jié)果與文獻報道相一致[13]。紅外分析結(jié)果說明，成功制備了季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2抗菌納米粒子。

2.4 Zeta電位分析

用Zeta電位分析儀測試了樣品的Zeta電位，結(jié)果如圖4所示。

圖4 Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-PEI和Fe3O4@SiO2-QPC的Zeta電位

由圖4可以看出，F(xiàn)e3O4@SiO2的Zeta電位是-22.31 mV，這是由于SiO2表面富含羥基，在水溶液中呈現(xiàn)負電性，測試結(jié)果與其相符。Fe3O4@SiO2-PEI的Zeta電位為+30.12 mV，因為Fe3O4@SiO2經(jīng)過PEI修飾表面富含氨基，在水溶液呈正電性，測試結(jié)果與之相吻合。而Fe3O4@SiO2-QPC的Zeta電位為+38.95 mV，這是因為將納米粒子季銨化之后，季氮原子呈正性，材料表面正電荷增多。電位分析結(jié)果也說明了本研究中季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子的成功制備。

2.5 磁性能分析

在室溫下測試樣品的磁性能，磁滯回曲線如圖5所示。

圖5 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC(c)的磁滯回曲線

圖5中，右下角插圖為樣品分散在水中，能用磁鐵快速回收的圖片。

Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC的飽和磁化強度分別為73.9、32.4、25.7 emu/g，包覆殼層之后使得樣品的磁化強度減弱。從圖5可以看出，磁滯回曲線經(jīng)過原點呈現(xiàn)出標準的S形，剩磁幾乎為0，即樣品在外加磁場消失之后磁性也消失，說明樣品具有超順磁性。這在磁分離以及再分散方面有著極大的優(yōu)勢，如圖5中右下角的插圖所示。將一定量季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子分散于水中，使用磁鐵施加外加磁場，納米粒子迅速向磁鐵方向移動，20 s就能實現(xiàn)全部回收。并且在撤銷磁鐵之后，搖晃瓶子，樣品又能夠快速又均勻地重新分散在水之中。

2.6 抗菌性能分析

抗菌實驗以氯化前后的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC作為對照實驗，最小抑菌濃度法的結(jié)果見表1。

表1 最小抑菌濃度法對樣品進行抗菌測試的結(jié)果

未經(jīng)氯化的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為256 μg/mL和512 μg/mL。經(jīng)過氯化作用之后的樣品Fe3O4@SiO2-QPC對葡萄球菌和大腸桿菌最小抑菌濃度分別為32 μg/mL和64 μg/mL。氯化之后的樣品比未氯化的樣品的最小抑菌濃度要低，說明氯化之后抗菌效果要好。

為了進一步考察樣品的抗菌效果，又對氯化前后的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC進行了抗菌動力學(xué)實驗，結(jié)果見表2。

表2 對樣品進行抗菌動力學(xué)測試的結(jié)果

注：a為細菌濃度7.61×105CFU/樣品； b為細菌濃度1.02×106CFU/樣品。

未氯化的樣品Fe3O4@SiO2-QPEI在30 min內(nèi)對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的對數(shù)減少值都有所降低，這是由于Fe3O4@SiO2-QPEI抗菌是由納米粒子表面季銨鹽的季氮原子起作用，其帶正電荷，而細菌表面帶負電荷，抗菌納米粒子會吸附到細菌的表面，與其接觸，使蛋白質(zhì)變性或者破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，從而達到抗菌的作用。氯化之后的樣品Fe3O4@SiO2-QPC能夠在30 min內(nèi)殺死100%的兩種細菌，其抗菌是協(xié)同季銨鹽抗菌及N-鹵胺抗菌機理，在季氮原子正電荷起作用的同時，N-鹵胺中N-Cl鍵水解，釋放出的Cl+具有強氧化作用，可破壞細胞膜結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致細胞失活。由表2還可以看出，二者對金黃色葡萄球菌的抗菌效果都比大腸桿菌好。這是由于大腸桿菌是典型的革蘭氏陰性菌，與革蘭氏陽性菌黃色葡萄球菌相比，除了有一層細胞壁之外，還有一層細胞外膜，不利于抗菌劑向細胞壁接近，所以，季銨化鹵胺聚合物改性Fe3O4@SiO2納米粒子對革蘭氏陽性菌的抗菌效果要優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

3 結(jié) 語

本實驗成功制備了Fe3O4@SiO2-QPC納米粒子，1H-NMR表明了小分子BHD的成功合成，利用FT-IR和TEM對樣品進行結(jié)構(gòu)和形貌表征，表明聚合物成功接枝在Fe3O4@SiO2表面，納米粒子有明顯的核殼結(jié)構(gòu)。通過磁性測試證明了樣品可以通過外加磁場實現(xiàn)回收，可對樣品重新氯化反復(fù)使用。以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌進行抗菌測試，結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@SiO2-QPC納米粒子能夠協(xié)同季銨鹽及鹵胺抗菌機理，30 min內(nèi)能使全部細菌失去活性，比未氯化樣品Fe3O4@SiO2-QPEI抗菌效果好。