連續(xù)流動分析儀與自動凱氏定氮儀測定土壤全氮含量比較

宋書會，張金堯，汪 洪

［中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，國家化肥質量監(jiān)督檢驗中心（北京），農業(yè)農村部農產品質量安全肥料源性因子風險評估實驗室（北京），北京 100081］

氮是植物生長需求的主要營養(yǎng)元素，土壤氮主要包括有機氮和無機氮兩種主要形態(tài)，是評價土壤供氮能力的指標，無機氮主要包括NO2-、NO3-、可交換態(tài)NH4+和被黏土固定的不可交換態(tài)NH4+，有機氮主要存在于土壤有機質、植物殘體中，有機氮和無機氮通過固定、礦化作用相互轉化［1］。在土壤科學、植物營養(yǎng)學、生物化學等領域對土壤營養(yǎng)供應、植物營養(yǎng)吸收等的研究均需測定土壤全氮含量［2］。

土壤全氮含量的測定主要為濕燒法和干燒法。凱氏定氮法為濕燒法，是傳統(tǒng)的土壤全氮含量測定方法，主要包括蒸餾和滴定，首先用硫酸消煮土壤樣品，將有機氮轉化為無機氮以NH4+的形式存在，之后再測定消煮液中的銨。此方法之后被不斷改進，主要為催化劑的使用和NH4+-N的測定，在消煮過程中可用K2SO4、CuSO4、Se、TiO2等作為催化劑加速氧化［3］，縮短消煮時間；消煮液中銨的測定方法主要包括蒸餾滴定法、擴散法和比色法［4］。NH4+的蒸餾和滴定是最常見的方法，即向消煮液中加入堿溶液，NH4+以NH3的形式揮發(fā)出被標準酸吸收，之后用標準酸液反向滴定。然而每個消煮的待測液需要15 min完成蒸餾-滴定過程，耗費時間較長［5］，即使采用自動定氮儀，蒸餾完成一個樣品也需5 min左右［6］。靛酚藍比色法也可用來測定消煮液中的NH4+，即堿性條件（pH值13.0左右）下銨和次氯酸根反應生成氯胺，用硝普鈉催化，氯胺與水楊酸反應形成藍綠色化合物，在波長660 nm處比色測定［7］，此過程較為簡單，不需要較大的空間和特殊的實驗設備［8］。

連續(xù)流動分光光度法測定NH4+-N主要根據靛酚藍反應的原理，連續(xù)流動分析技術測定植物中全氮含量的結果與傳統(tǒng)蒸餾滴定法的結果沒有較大差異，連續(xù)流動分析方法測試速度較快，樣品交叉污染小，廣泛應用于農業(yè)、食品、環(huán)境監(jiān)測等領域［9-12］。土壤全氮采用凱氏法消煮，連續(xù)流動分析儀測定還缺乏相應的研究，自動凱氏定氮儀測定結果與連續(xù)流動分析儀測定結果之間關系還不甚清楚。選擇50個土壤樣品和2個標準土壤樣品用凱氏法消煮，連續(xù)流動分析儀測定消煮液中的NH4+，結果與自動凱氏定氮儀測定結果相比較，以探討連續(xù)流動分析儀-靛酚藍比色法，測定凱氏消煮液中NH4+含量方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

農田采集的土壤樣品于干凈通風的室內自然風干，過0.149 mm篩［13］。土壤標準物質為河南黃潮土GBW07413a（ASA-2a）和江西紅壤GBW07416a（ASA-5a）。

1.2 樣品消煮

稱取過0.149 mm篩的土壤樣品1.000 g于100 mL消煮管中，加入2.0 g催化劑（K2SO4∶CuSO4∶Se=100∶10∶1，混合均勻，磨細過0.149 mm篩）和5 mL濃硫酸，搖勻，置于自動消解系統(tǒng)上加熱，升溫速度5℃/min，升溫至200℃，保持30 min，繼續(xù)加熱至340℃，直至消煮液澄清，繼續(xù)加熱1 h。冷卻至室溫，去離子水定容至100 mL，搖勻以備分析測試。

1.3 自動凱氏定氮儀測定消煮液中NH4+-N

1.3.1 儀器設備

自動凱氏定氮儀的蒸餾儀型號：KjelFlexK-360，配置自動滴定儀型號：DL15，滴定管體積20 mL，分辨率1/10 000，電極DG115-SC，電位分辨率0.1 mV。

1.3.2 蒸餾滴定過程

1.3.2.1 試劑配置 （1）40% 氫氧化鈉：溶解40.0 g 氫氧化鈉于100 mL去離子水中；（2）20 g/L 硼酸：稱取20.0 g 硼酸，溶于適量水中，定容至1 000 mL；（3）0.02 mol/L（1/2 H2SO4）：去離子水稀釋2.83 mL H2SO4到 5 L；（4）0.01 mol/L（1/2 H2SO4）：將0.02 mol/L（1/2 H2SO4）（即配置3）準確稀釋2倍，并用硼砂溶液標定之。方法如下：準確稱取硼砂Na2B4O7·10H2O 1.907 1 g，溶于蒸餾水中，轉移定容至1 L容量瓶，搖勻，即為0.01 mol/L的標準溶液。吸取3份該溶液各25.00 mL于3個三角瓶中，以甲基紅做指示劑，以上述標準硫酸滴定至紅色終點，分別記錄消耗體積，計算0.01 mol/L（1/2 H2SO4）標準溶液濃度。

1.3.2.2 參數(shù)設置 準確移取20.00 mL消煮液轉移至自動凱氏定氮儀專用蒸餾管中，打開自動凱氏定氮儀和配套的自動滴定儀開關，打開冷凝用自來水閥，將滴定儀上pH電極插入定氮儀接收瓶中。選擇儀器“預先準備程序”，進行樣品測定方法編輯，設定主要參數(shù)：加入40%氫氧化鈉溶液30 mL、20 g/L硼酸接收液（pH值4.65）20 mL、蒸汽力度100%、反應時間5 s、蒸餾時間250 s、蒸餾結束后自動啟動滴定，編輯完畢后保存，按定氮儀上啟動開始鍵，開始自動蒸餾滴定。儀器測定之前，選擇“清洗程序”，安裝干凈的空樣品管，清洗儀器3次，儀器空白值相差＜0.05 mL開始測定。

1.4 連續(xù)流動分析儀測定消煮液中NH4+-N

1.4.1 儀器設備

連續(xù)流動分析儀，配置有MT7化學模塊、操作軟件AACE，圖1為AA3連續(xù)流動分析儀結構示意圖［14］。主要組成部分：進樣系統(tǒng)、蠕動泵、化學分析模塊、比色系統(tǒng)。

圖1 AA3連續(xù)流動分析儀結構圖

1.4.2 操作過程及分析條件

1.4.2.1 試劑配制 （1）緩沖液：稱取35.8 g 磷酸二氫鈉，32.0 g氫氧化鈉，50.0 g酒石酸鉀鈉于600 mL水中，定容至1 000 mL；（2）水楊酸鈉溶液：40.0 g水楊酸鈉溶于600 mL蒸餾水，加入1.0 g硝普鈉，稀釋至1 000 mL，混均存放于棕色試劑瓶中；（3）次氯酸鈉溶液：將3.0 mL次氯酸鈉溶液（有效氯含量8%～10%）加入于60 mL蒸餾水中，稀釋至100 mL，混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；（4）4% 硫酸溶液：移取40.0 mL濃硫酸稀釋至1 000 mL；（5）硫酸銨儲備液（N 1 000 mg/L）：準確稱取4.717 g硫酸銨（120℃烘干2 h）溶于600 mL蒸餾水中，攪拌溶解，混合均勻，定容至1 000 mL。

1.4.2.2 參數(shù)設置 選擇防酸進樣針和高濃度進樣管，設置進樣速率50個樣/h，進樣與清洗比為2.0∶1，進樣時間48 s，清洗時間24 s。儀器默認設置基線和漂移校正，自動基線參比為5%；比色濾光片波長為660 nm，燈強度大于l 000 mV。樣品消煮液中含氮量在連續(xù)流動分析儀線性測量范圍（＜N 50 mg/L）內，無需稀釋。

1.4.2.3 標準曲線制作 移取10.0 mL硫酸銨儲備液（即試劑配制5），定容至100 mL，混合均勻，即濃度為100 mg/L的NH4+-N標準溶液，分別吸取0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mL的NH4+-N標準溶液于50 mL容量瓶，用4%硫酸定容至50.0 mL。即NH4

+-N濃度為0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mg/L的NH4+-N系列標準溶液，按照上述連續(xù)流動分析儀條件進行測定，儀器測定峰高與標準溶液NH4+-N濃度之間進行線性回歸，制作標準曲線如圖2所示，其中 r2=0.999。

圖2 連續(xù)流動分析儀測定NH4+-N標準曲線

1.5 統(tǒng)計分析和實驗設計

測量值Xi的算術平均值為樣品全氮估計值，標準偏差用貝塞爾公式計算［15-16］：

相對標準偏差（RSD%）=標準偏差/計算結果算術平均值×100；

分別采用連續(xù)流動分析儀和自動凱氏定氮儀測定50個樣品和2個國家土壤標準物質全氮含量，兩測定結果之間做相關回歸分析。2個國家土壤標準物質和3個土壤樣品分別用凱氏法消煮7次，連續(xù)流動分析儀測定消煮液中NH4+-N含量，以評估連續(xù)流動分析儀測定凱氏消煮液中NH4+-N含量的準確度和精密度。

2 結果與分析

2.1 土壤全氮

連續(xù)流動分析儀和自動凱氏定氮儀對50個土壤樣品的測定結果見圖3。連續(xù)流動分析儀測定的土壤全氮范圍為0.68～2.06 g/kg，自動凱氏定氮儀測定的全氮范圍為0.71～1.95 g/kg。

圖3 連續(xù)流動分析儀和自動凱氏定氮儀測定土壤全氮含量

對連續(xù)流動分析儀和自動凱氏定氮儀測定土壤全氮含量進行相關性分析，由圖4可知，回歸方程為y（連續(xù)流動分析儀-NH4+-N）=0.995 1x（自動凱氏定氮儀-NH4+-N）+ 0.003 5，相關系數(shù)r=0.980（n=50，P＜0.01），斜率為 0.995 1 ，接近于 1。

圖4 連續(xù)流動分析儀法和自動凱氏定氮儀法結果相關分析

2.2 配對樣品t檢驗

表1顯示，連續(xù)流動分析儀與自動凱氏定氮儀測定土壤全氮平均值均為1.07 g/kg，標準偏差分別為 0.219、0.215，相關系數(shù) r為 0.980，且P＜0.01，兩測定結果之間極顯著相關；t檢驗結果表明，雙尾檢驗P＞0.05，兩種方法測定全氮含量沒有明顯差異，呈極顯著線性相關。

表 1 配對樣品t檢驗

2.3 連續(xù)流動分析儀測定準確度

同上述連續(xù)流動分析儀測試條件，兩個標準土（河南黃潮土和江西紅壤）凱氏法消煮、連續(xù)流動分析儀測定消煮液中NH4+-N含量，每個樣品重復消煮7次，評估連續(xù)流動分析儀測定全氮結果的準確度（表2）。結果顯示，連續(xù)流動分析儀測得兩個標準土相對標準偏差分別為1.67%和3.09%，河南黃潮土氮含量為0.76 g/kg，在標準土確認值（0.77±0.03）g/kg范圍內；江西紅壤氮含量測定值為0.54 g/kg，介于江西紅壤氮含量標準確認值（0.54±0.04）g/kg之間。因此，土壤全氮凱氏法消煮-連續(xù)流動分析儀測定NH4+-N含量方法準確度較高。

表2 連續(xù)流動分析儀測定土壤標準物質全氮含量

2.4 連續(xù)流動分析儀測定精密度

3個土壤樣品凱氏法消煮7個重復，連續(xù)流動分析儀測定消煮液中NH4+-N含量，結果顯示測定結果的相對標準偏差在1.19%～1.46%之間，均小于5%（表3）。連續(xù)流動分析儀測定土壤全氮精密度較好。

表3 連續(xù)流動分析儀重復測定樣品全氮含量

2.5 連續(xù)流動分析儀測定方法檢出限

重復測定20個試劑空白實驗，圖5為試劑空白測定結果。計算試劑空白測定結果的標準偏差，三倍空白標準偏差［17］作為檢出限估計值，即檢出限MLD=3×SD，得到本測定方法檢出限的N質量濃度為0.128 mg/L。

圖5 連續(xù)流動分析儀測定空白信號值

3 討論

與傳統(tǒng)的全自動蒸餾滴定法相比，連續(xù)流動分析儀包括自動進樣系統(tǒng)、蠕動泵、化學分析模塊、比色系統(tǒng)和數(shù)據處理系統(tǒng)，能夠實現(xiàn)自動進樣、自動分析檢測［18］。連續(xù)流動分析儀測定土壤全氮過程中，消煮液、緩沖液、水楊酸鈉、次氯酸鈉進樣量分別為0.23、0.80（單管）、0.23、0.23 mL/min。圖1顯示，緩沖液的最大需求量為1.60 mL/min。考慮到每天8 h工作時間和其他因素，上述試劑每天用量分別為110.4、768.0、110.4、110.4 mL，連續(xù)流動分析儀測定土壤全氮所用試劑量遠小于自動蒸餾滴定技術。試劑配制和儀器調試約需要2 h，按照進樣速率50個/h，一天可以測定300樣次［6］。連續(xù)流動分析儀測定NH4+-N節(jié)省時間和人力，效率較高。

95%置信區(qū)間成對樣品T檢驗結果顯示，連續(xù)流動分析儀測定土壤全氮和凱氏法測定土壤全氮含量一致。Junsomboon等［19］研究流動注射系統(tǒng)（FIC法）測定牛奶、雞蛋和肉制品中凱氏氮含量，結果顯示FIC法測得結果和凱氏法測得結果之間具有極顯著線性相關，且方法檢出限為1 mg/L。本實驗中連續(xù)流動分析儀測定NH4+-N與自動凱氏定氮儀測定NH4+-N結果間具有顯著線性相關，回歸方程為y（連續(xù)流動分析儀-NH4+-N）=0.995 1x（自動凱氏定氮儀-NH4+-N）+0.003 5 ，相關系數(shù)r=0.980，連續(xù)流動分析儀測定NH4+-N檢出限為0.128 mg/L。連續(xù)流動分析儀測定土壤全氮的相對標準偏差均小于5%，精密度較高，且測定值均介于標準確認值范圍內，測試結果較為準確。

4 結論

連續(xù)流動分析儀測定土壤全氮能夠克服傳統(tǒng)方法的缺點，相對標準偏差在5%以下，與全自動凱氏蒸餾滴定法測定結果間無明顯差異，連續(xù)流動分析儀測定結果的準確度、精確度均較高。鑒于連續(xù)流動分析儀法具有節(jié)省人力、節(jié)約試劑、提高工作效率等優(yōu)點，可適用于大批量土壤全氮含量的分析測定。