轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在哮喘疾病診斷中的應(yīng)用展望

潘 赫，谷奕諾，左 旭，鄭敬彤

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021)

哮喘是一種常見(jiàn)慢性氣道炎癥，由于無(wú)法預(yù)防或完全治愈嚴(yán)重威脅著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和人類(lèi)的身體健康[1,2]。據(jù)GHDx數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)(http://ghdx.healthdata.org/)，1990年至2012年全球哮喘病死亡人數(shù)顯著下降，死亡率也由1.3%下降至0.83%。但由于多方面的復(fù)雜因素如哮喘的耐藥性，新過(guò)敏原等問(wèn)題導(dǎo)致近幾年因哮喘而死亡的人數(shù)有上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的身心健康，已成為當(dāng)前危害公共健康的主要疾病之一(圖1)。哮喘的規(guī)范化管理和防治近年受到了普遍關(guān)注，哮喘管理和防治的全球策略已在大多數(shù)國(guó)家推廣應(yīng)用。但目前上海、北京的調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)哮喘防治水平與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家仍有較大差距，哮喘的控制率仍很低。

哮喘疾病的產(chǎn)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，其中，變應(yīng)性氣道炎癥 (AAI) 作為典型的哮喘病理基礎(chǔ)，具有氣道反應(yīng)性高、氣道炎癥反應(yīng)明顯、黏液分泌增多、氣道重塑等主要特點(diǎn)[3,4]。如果以患者作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究疾病的發(fā)生機(jī)制，過(guò)程十分緩慢，而且許多實(shí)驗(yàn)在倫理上和方法上也受到限制，局限性很大。通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型進(jìn)行間接研究可以人為控制各類(lèi)影響因素，同時(shí)也回避了人體實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的不良影響，能更有效研究動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人類(lèi)疾病之間的異同，有助于更清晰有效地認(rèn)識(shí)人類(lèi)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，為探索哮喘發(fā)病機(jī)理、提出新的診斷方法以及補(bǔ)充新的診斷依據(jù)提供了模型基礎(chǔ)[5]。

本文將從哮喘診斷的常規(guī)方法以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在哮喘疾病診斷上的應(yīng)用前景兩方面進(jìn)行描述，闡明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型對(duì)哮喘疾病診斷的應(yīng)用前景，將對(duì)指導(dǎo)合理診斷、有效地選擇臨床用藥，具有切實(shí)的意義。

A.1990年至2018年全球因哮喘導(dǎo)致死亡的人數(shù)； B.1990年至2018年全球哮喘患者死亡率

1 哮喘的常規(guī)診斷方法

根據(jù)中國(guó)《支氣管哮喘防治指南(2016 年版)》[6]，支氣管哮喘診斷要點(diǎn)主要包括典型的哮喘臨床癥狀和體征以及可變氣流受限的客觀檢查等。在符合上述癥狀和體征的同時(shí)具備氣流受限，即可診斷為支氣管哮喘。通過(guò)分析支氣管哮喘防治指南可以看出，支氣管防治主要以患者實(shí)際體征出發(fā)，而較少提及高危人群的基因篩查診斷，以及利用基因差異進(jìn)行疑似患者的跟蹤隨訪等。

2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的診斷前景分析

由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有可復(fù)制性、可控性、縮短實(shí)驗(yàn)周期、有助于全面認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)的特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸成為研究人類(lèi)疾病的發(fā)展規(guī)律以及疾病防治機(jī)理的重要工具之一。 其中Nrf2、IL-35、 HLA-DR、IL-33等轉(zhuǎn)基因模型在哮喘中影響如下。

2.1 Nrf2基因缺陷鼠

研究表明，Nrf2基因缺陷鼠在哮喘造模后，氣道更敏感，氣道高反應(yīng)性更明顯，肺泡灌洗液中，炎性因子和炎性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，提示Nrf2缺陷鼠能較好的模擬哮喘的發(fā)生發(fā)展[7,8]。此外，研究者通過(guò)體外建立姜黃素干預(yù)哮喘Balb/c小鼠模型以及體內(nèi)建立姜黃素干預(yù)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7模型[9]，結(jié)果顯示姜黃素能激活哮喘小鼠肺組織及RAW264.7細(xì)胞的Nrf2及HO-1的表達(dá)與含量，并調(diào)整Nrf2與ARE的結(jié)合活性。此外，高脂蛋白通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路也能改善OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性氣道炎癥[10]。因此，Nrf2基因的表達(dá)情況對(duì)未來(lái)建立的哮喘患者診斷標(biāo)準(zhǔn)可能具有十分重要的作用，可通過(guò)獲取患者血液或者組織標(biāo)本后對(duì)Nrf2基因情況進(jìn)行鑒定，從而達(dá)到對(duì)高危人群進(jìn)行基因篩查的目的。

2.2 IL-35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠

IL-35是最新發(fā)現(xiàn)的IL-12細(xì)胞因子家族成員，是由EBI3和IL-12p35兩個(gè)亞基組成的異二聚體。其中EBI3由EB病毒感染的B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，編碼為34 kDa的糖蛋白，與IL-12p40有27%的氨基酸同源性[11]。而IL-12p35通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)B細(xì)胞中IL-10表達(dá)和IL-35表達(dá)的增加，并能通過(guò)對(duì)抗Th17致病性反應(yīng)改善小鼠自身免疫性葡萄膜炎[12]。修晶輝[13]利用酶切回收pCMV6-XL5-h-IL35片段并克隆入質(zhì)粒中，構(gòu)建IL-35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，再用OVA刺激誘導(dǎo)的哮喘模型來(lái)研究IL-35在變態(tài)反應(yīng)中抑制炎癥發(fā)生的作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明IL-35通過(guò)促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞因子IL-17分泌的途徑抑制哮喘炎癥的發(fā)生和粘液的分泌，具有明顯的抑制哮喘的作用。因此，如果成功構(gòu)建了高危人群基因篩查診斷庫(kù)，IL-35基因過(guò)表達(dá)患者在基因篩查的時(shí)候應(yīng)格外引起重視。

2.3 HLA-DR2和HLA-DR3轉(zhuǎn)基因小鼠

HLA-DR是MHC-II類(lèi)分子，表達(dá)于B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、活化T淋巴細(xì)胞和活化NK淋巴細(xì)胞表面上。研究表明HLA-DR系列基因與哮喘及其相關(guān)表型有關(guān)[14,15]。Rajagopalan,G等[16]為了擴(kuò)展這一觀察并證明這種關(guān)聯(lián)，通過(guò)使用室內(nèi)塵螨提取物對(duì)HLA-DR2和HLA-DR3轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行刺激致敏，比較HLA-DR3、HLA-DR2轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞因子水平之間的差異。 研究顯示皮下增敏后再接受塵螨提取物鼻腔刺激的轉(zhuǎn)基因小鼠，其肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞以及IL-4和IL-13會(huì)顯著升高。結(jié)果表明，攜帶HLA-DR2和HLA-DR3基因的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠通過(guò)抗原特異性T細(xì)胞誘發(fā)炎癥反應(yīng)。 因此，HLA-DR基因?qū)ο颊呋蛟\斷標(biāo)準(zhǔn)的建立可能具有一定的輔助作用。

2.4 IL-33和ST2缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠

IL-33屬于IL-1細(xì)胞因子家族，通過(guò)ST2膜受體誘導(dǎo)Th2免疫應(yīng)答，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[17,18]。上皮細(xì)胞是IL-33的主要產(chǎn)生者，然而骨髓細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等其他細(xì)胞也可分泌。例如，IL-33靶向的細(xì)胞類(lèi)型廣泛攜帶ST2表面受體。許多ST2陽(yáng)性細(xì)胞，如Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞，參與了哮喘的發(fā)展，提示IL-33直接參與哮喘發(fā)病機(jī)制[19,20]。目前，針對(duì)單克隆抗體在哮喘小鼠模型中阻斷IL-33及其受體已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，IL-33和ST2缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠也已經(jīng)構(gòu)建成功[21,22]。研究結(jié)果提示IL-33和ST2基因突變可能對(duì)哮喘患者的Th2免疫應(yīng)答起重要作用。

3 小結(jié)和展望

哮喘患者在早期發(fā)病時(shí)癥狀不明顯甚至無(wú)癥狀，導(dǎo)致臨床工作中很難對(duì)哮喘進(jìn)行預(yù)防診斷，而基因的診斷可能會(huì)為哮喘的預(yù)防以及診斷提供了很好的方向。本文通過(guò)探討Nrf2、IL-35、 HLA-DR、IL-33等轉(zhuǎn)基因模型對(duì)哮喘嚴(yán)重程度以及表型的影響，分析了上述基因?qū)⒒颊吆Y查以及診斷標(biāo)準(zhǔn)的重要性。通過(guò)分析基因表達(dá)情況可以有效篩查出易患病的高危人群，可及時(shí)對(duì)潛在的哮喘患者進(jìn)行隨訪，做到早預(yù)防、早診斷、早治療，對(duì)哮喘的輔助診斷具有重大意義。