微流控平臺技術(shù)檢測循環(huán)腫瘤細胞在非小細胞肺癌早期診斷的初步研究

丁光貴，王小艷，萬 軍，丁培堃，黃同海

(1.深圳市人民醫(yī)院 胸外科,廣東 深圳518020;2.深圳市蛇口人民醫(yī)院社區(qū)衛(wèi)生服務中心,廣東 深圳518020)

非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率死亡率均位居惡性腫瘤第一位[1,2]。研究表明，可通過檢測肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTC)對腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)進行早期診斷[3]。本研究選取了一種基于微流控平臺的循環(huán)腫瘤細胞分選儀器，通過對分選出的CTC通過免疫化學染色計數(shù)，與常規(guī)腫瘤標記物進行對比，探討CTC檢測用于NSCLC早期診斷的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

觀察對象為2017年01年至2019年01月期間在深圳市人民醫(yī)院確診為NSCLC的65例癌癥患者。入組標準：年齡18-80周歲，性別不限；病理診斷為NSCLC患者，所有患者均接受肺部CT掃描，腹部B超，全身骨ECT，頭顱MRI及相關(guān)實驗室檢查以明確分期及遠處轉(zhuǎn)移；既往無腫瘤病史；入院前未接受抗腫瘤的相關(guān)治療。排除標準：臨床檢驗判定小細胞肺癌或其他惡性腫瘤；合并其他腫瘤患者。本研究已經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者對研究知情并簽署知情同意書。

1.2 材料和儀器

NCI-H1975 (非小細胞肺癌細胞系)購自中國科學院細胞庫，活細胞熒光染料Celltracker CMFDA(貨號：C7025)、細胞核染料Hoechst33342(貨號：H1399)、磁力架(貨號：A31543)購自美國Thermo Fisher公司；低速大容量離心機購自上海安亭科學儀器廠；垂直混合儀和微型水平脫色搖床購自江蘇海門其林貝爾公司；微型臺式真空泵購自上海斯曼峰醫(yī)療器械公司；熒光顯微鏡及單細胞挑取系統(tǒng)購自奧林巴斯(深圳)工業(yè)有限公司，ClearCell○RFX1循環(huán)腫瘤細胞活性分離系統(tǒng)購自新加坡的Clearbridge生物醫(yī)學公司，CTC鑒定染色過程的細胞固定液、透化液、封閉液、抗體稀釋液、抗體混合液(含偶聯(lián)過氧化氫酶pan-CK-抗體和偶聯(lián)堿性磷酸酶CD45)、酶顯色底物等配套試劑由深圳華大生命科學研究院提供支持。

采用化學發(fā)光法檢測腫瘤標記物NSE(貨號：CPO11070)、CEA(貨號：CPO11050)、Cyfra21-1(貨號：CPO11040)由深圳市人民醫(yī)院檢驗科采用上海透景生命科技股份有限公司相關(guān)試劑盒檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1細胞培養(yǎng) NCI-H1975細胞用含有10%熱滅火胎牛血清100 IU/ml青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)的細胞用DPBS 磷酸緩沖液洗滌2次后用0.25%胰蛋白酶消化傳代或收獲細胞。

1.3.2細胞摻入與細胞回收率統(tǒng)計 NCI-H1975細胞培養(yǎng)至融合度約為80%后用胰酶進行消化，加入Celltracker CMFDA染色工作液，于細胞正常生長條件下孵育30 min。換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 min，將細胞用PBS漂洗后，在熒光顯微鏡下使用單細胞挑取系統(tǒng)挑取準確數(shù)量的細胞，按照5CTC/3 ml、25CTC/3 ml、50CTC/3 ml摻入全血中，每組設(shè)3個組內(nèi)平行。

分別按照CTC定量檢測試劑盒及ClearCell○RFX1循環(huán)腫瘤細胞活性分離系統(tǒng)說明書進行CTC分離操作，得到的細胞懸液置于96孔板中，在熒光顯微鏡下進行觀察計數(shù)。按以下公式進行回收率計算：CTC回收率=觀測CTC數(shù)量/摻入CTC總數(shù)×100%。

1.3.3CTC的定量檢測 每位受試者采5 ml血液樣本，用含肝素鈉的BD Vacutainer管收集后保存于4℃冰箱，并且在采集后6 h內(nèi)進行處理。CTC的定量檢測按照ClearCell○RFX1循環(huán)腫瘤細胞活性分離系統(tǒng)說明書進行操作。CTC分離后，按照邁新生物雙重免疫化學染色標準步驟進行染色鑒定，在熒光顯微鏡明場下進行觀察并計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC分離回收效率

通過CTC分離回收效率公式計算標記并染色的NCI-H1975細胞回收效率。實驗結(jié)果顯示，通過循環(huán)腫瘤細胞滲入實驗，NCI-H1975細胞的回收率為(83.3-86.3)%，平均值為(85.0±1.5)%(表1)。

表1 循環(huán)腫瘤細胞回收情況

2.2 細胞形態(tài)鑒定

為確定經(jīng)免疫化學染色鑒定后的腫瘤細胞形態(tài)特征，我們先對NCI-H1975肺癌細胞系、正常人外周血單核細胞PBMC進行了染色鑒定，染色后腫瘤細胞呈現(xiàn)典型的紅色，PBMC染色后呈現(xiàn)典型的藍黑色，形態(tài)特征見下圖1。

圖1 NCI-H1975和PBMC細胞染色后40倍顯微鏡下細胞形態(tài)圖

2.3 納入病人臨床信息

本研究共納入65例NSCLC患者的相關(guān)信息，其中男性患者38(58.5%)例，女性患者27(41.5%)例?；颊叩钠骄挲g為58.6(25-79)歲，Ⅰ期患者17(26.2%)例，Ⅱ期患者16(24.6%)例，Ⅲ期患者14(21.5%)例，Ⅳ期患者18(27.7%)例。

2.4 微流控平臺與常規(guī)腫瘤標志物檢測結(jié)果對比

為了評估CTC檢測在NSCLC術(shù)前輔助診斷的價值，我們對65例NSCLC患者的臨床全血樣本進行了檢測，并與臨床常規(guī)腫瘤標志物進行對比分析。在65例NSCLC樣本中，大部分有CTC檢出，但在早期檢出的CTC數(shù)量較少。I期中8例沒有檢出，有6例只有1個CTC檢出；Ⅱ期中有6例只有1個CTC檢出，6例有2個CTC檢出；Ⅲ期和Ⅳ檢出的CTC數(shù)目相對較多。與化學發(fā)光法檢測常規(guī)腫瘤標記物(NSE/CEA/Cyfra21-1)作為早期診斷的結(jié)果相比，在65例腫瘤患者樣本中，傳統(tǒng)腫瘤標記物的檢出為34例，檢出率52.3%，CTC檢測的檢出為57例，檢出率為87.7%，兩者相比P<0.01；中晚期(Ⅲ-Ⅳ期)的CTC檢出數(shù)量與早期(Ⅰ-Ⅱ期)相比，P<0.01，具有統(tǒng)計學差異(表2和圖2)。

表2 微流控平臺與常規(guī)腫瘤標志物檢測結(jié)果匯總

圖2 不同TNM分期患者樣本CTCs檢出細胞數(shù)統(tǒng)計圖，CTCs(Ⅲ-Ⅳ)顯著高于CTCs(Ⅰ-Ⅱ)，P<0.01

3 討論

研究表明，循環(huán)腫瘤細胞與多種惡性腫瘤的臨床病理分期及預后密切相關(guān)，其在遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)中的作用也日益受到關(guān)注[4]。由于外周血循環(huán)腫瘤細胞水平極低 ，這使得富集分離循環(huán)腫瘤細胞挑戰(zhàn)巨大。 目前，包括基于細胞物理學特性的方法、基于磁性親和選擇的分選方法和基于微流體的生物學的分選方法在內(nèi)，各種循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)發(fā)展迅速，但大多處于研發(fā)階段，從技術(shù)平臺和臨床應用角度仍有巨大發(fā)展空間。微流控技術(shù)是近些年在循環(huán)腫瘤細胞檢測領(lǐng)域新興的重要技術(shù)平臺，其利用不同方法的捕獲效率基本在70%以上[5,6]。本研究選取了一種具有高效、不依賴腫瘤細胞表面標志物特點的基于微流控平臺的循環(huán)腫瘤細胞分選儀器，其原理是基于尺寸大小不同的細胞在微流控芯片中表現(xiàn)出力學特征的不同，從而通過慣性遷移達到分離的效果[7，8]。從摻入腫瘤細胞的健康人血樣模擬腫瘤患者血樣的試驗結(jié)果來看，微流控平臺具有較高的循環(huán)腫瘤細胞捕獲效率(85.0±1.5)%，優(yōu)于一些研究報道的腫瘤細胞捕獲效率[9]。例如：應用納米多孔碳酸酯膜的親和性分選法對于PC-3細胞混于白細胞的捕獲效率為70%[10]。采用金電極、PDMS微管道的雙相電泳分選法對混于血液的MCF-7細胞的捕獲效率為75%左右[11]。值得一提的是，該試驗是在血液量較少的情況下完成(5 ml)，而利用密度梯度離心法分類CTCs需要15-30 ml的血量，陽性富集法的Cellsearch系統(tǒng)需要7.5 ml的血量[12]。這提示該方法在血液數(shù)量不多的情況也能檢測，比一些CTCs檢測具有優(yōu)勢。

NSCLC近年來發(fā)病率不斷增高，目前在全球范圍內(nèi)NSCLC的發(fā)病率和死亡率居于首位。我國雖然包括手術(shù)治療、藥物治療、放射治療等在內(nèi)的各種治療手段已經(jīng)取得巨大進步，但預后不良率較高且5年生存率與發(fā)達國家相比仍有巨大差距，腫瘤導致患者死亡的主要原因是由腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)引起的，而循環(huán)腫瘤細胞出現(xiàn)在惡性腫瘤患者外周血中是發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要條件[13，14]。本研究進一步通過對NSCLC患者術(shù)前血樣進行了CTC檢測，并與臨床常用的腫瘤標記物(/NSE/CEA/Cyfra21-1)檢測結(jié)果進行對比。結(jié)果顯示，晚期(Ⅲ-Ⅳ期)腫瘤患者CTC檢出數(shù)量顯著高于早期患者(Ⅰ-Ⅱ)，而CTC陽性檢出率和常規(guī)腫瘤標記物檢出率相比具有顯著的升高。本研究的不足之處在于沒有進行一定樣本數(shù)量的健康人群基線研究，入組的樣本數(shù)量有限。雖然微流控平臺還處于發(fā)展的早期階段，但其在臨床診斷分析上已顯示出敏感度高、需要樣本量少、效率高等優(yōu)勢。隨著技術(shù)的不斷完善，微流控技術(shù)有望在CTC檢測研究中發(fā)揮更重要的作用。