3D打印聚己內(nèi)酯多級管道支架促進梗死后心肌修復(fù)

研究表明，心肌補片移植于心肌梗死部位可以為心肌梗死區(qū)域提供良好的力學(xué)支持，改善心肌梗死后心臟左室重構(gòu)，減少心肌凋亡，進而改善心功能[1-3]。大多數(shù)相關(guān)研究集中在心肌補片良好的力學(xué)性質(zhì)上，而忽略其在促血管化方面的作用，而心肌再血管化對梗死后處于缺血的心肌細(xì)胞功能的恢復(fù)非常關(guān)鍵[4]。近年來，3D打印技術(shù)在心肌補片支架領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，可精準(zhǔn)設(shè)計特定的結(jié)構(gòu)促進移植區(qū)域的血管化，故心肌補片在促血管化方面有很好的應(yīng)用前景[5-6]。本研究中，我們通過3D打印技術(shù)，以蔗糖和聚已內(nèi)酯(PCL)為材料，制備多級管道支架，移植于SD大鼠心肌梗死區(qū)域，探討其對SD大鼠心肌梗死后再血管化作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量為200～250 g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部提供，動物生產(chǎn)許可證號為 SCXK(滬)2018-0006，使用許可證號為：SYXK(滬)2013-0050，將動物飼養(yǎng)在12 h光照、黑暗交替，恒濕恒溫環(huán)境下。

1.2 主要試劑和儀器

CD31抗體(1∶100，美國Abcam)；α-SMA抗體(1∶200，美國 Abcam )；DAPI(美國Vector)；Alexa Fluor 594熒光二抗(1∶1000，美國Thermo Scientific)；Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶200，美國Thermo Scientific)；小動物人工呼吸機(DW-3000A/B，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM-710，德國Zeiss)；PCL(80 000 g/mol，美國Sigma)；六氟異丙醇(HFIP，上海達瑞精細(xì)化工)；食用蔗糖(市售)；CD31抗體(1∶100，美國Abcam)；α-SMA抗體(1∶200，美國 Abcam)；DAPI(美國 Vector)；Alexa Fluor 594熒光二抗(1∶1000，美國Thermo Scientific)；Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶200，美國Thermo Scientific)；掃描電子顯微鏡(SEM, JSM-5600LV，日本JEOL)；力學(xué)試驗機(Exceed 40，美國MTS)小動物人工呼吸機(DW-3000A/B，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM-710，德國Zeiss)。

1.3 3D打印PCL多級管道支架

以市售蔗糖作為原料，在熔融沉積成型(FDM)打印機中加熱1 h，焦糖化處理后作為打印墨水；并進一步通過3D打印制備焦糖化模板，打印溫度為135 ℃。將4%的PCL/HFIP溶液，通過溶劑澆鑄法在模板表面形成涂層，然后通過犧牲模板法將焦糖化模板去除，經(jīng)過冷凍干燥后獲得PCL多級管道支架。將含有PCL涂層的蔗糖支架放置在載玻片上，在載玻片上滴加適量蒸餾水，使支架的一側(cè)與蒸餾水接觸，用顯微鏡觀察并視頻記錄蔗糖溶解的過程。通過SEM和力學(xué)試驗機表征PCL多級管道支架的結(jié)構(gòu)和力學(xué)參數(shù)。將PCL支架浸漬紅色染料溶液，觀察染液在管道中分布情況。

1.4 急性心肌梗死模型構(gòu)建及支架體內(nèi)移植

2%戊巴比妥(30 mg/kg)對SD大鼠進行腹腔麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)臺，行氣管插管，小動物呼吸機維持其呼吸。胸部去毛并消毒鋪巾，于左側(cè)第4～5肋間隙打開胸腔，打開心包，暴露SD大鼠心臟，6-0聚丙烯縫線于左心耳前下部約3～4 mm 處縫合，結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)，結(jié)扎后可觀察到心尖部及前壁心肌組織出現(xiàn)蒼白色，前壁收縮運動減弱。關(guān)閉胸腔并縫合皮膚，將SD大鼠送回動物房飼養(yǎng)。Sham組SD大鼠僅開胸，不結(jié)扎LAD。術(shù)后2 d行超聲檢查確定基線，篩選出射血分?jǐn)?shù)為40%～45%的SD大鼠16只，隨機分成2組，分別為MI組(n=8)和MI+scaffold組(n=8)。MI+scaffold組進行二次開胸，用6-0聚丙烯縫線將補片縫合于心臟表面，補片覆蓋梗死區(qū)域，Sham組和MI組僅二次開胸，關(guān)閉胸腔，縫合后將SD大鼠送回動物房飼養(yǎng)。

1.5 石蠟包埋及Masson染色

術(shù)后28 d取材SD大鼠心肌組織，浸于4%多聚甲醛固定24 h。將固定好的心肌組織置入不同濃度的酒精中脫水(75% 4 h、85% 2 h、90% 2 h、95% 1 h、100% 1 h)，將脫水的心肌組織石蠟包埋，于石蠟切片機上連續(xù)切片，每層5 μm，攤片，60 ℃烘烤后室溫保存?zhèn)溆?。將切片先用Weigert氏鐵蘇木素染5 min，自來水洗后，以1 %的鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗數(shù)分鐘后返藍。以麗春紅酸性品紅液染5～10 min后，蒸餾水快速漂洗，最后磷鉬酸水溶液處理3～5 min，苯胺藍液復(fù)染5 min。將染好的切片置于1%冰醋酸處理1 min，脫水封片，顯微鏡鏡檢觀察。

1.6 免疫熒光染色

將組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)液的高壓鍋內(nèi)進行抗原修復(fù)。冷卻后用PBS清洗甩干，加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。在切片上滴加一抗(CD31抗體+α-SMA抗體)，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；玻片置于PBS中洗滌3次，每次5 min，稍甩干后滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min；玻片置于PBS中洗滌3次，每次5 min，稍甩干后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，封片后于共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察并采集圖片，每個區(qū)域取3個視野，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3D打印PCL多級管道支架

3D打印機需要設(shè)定的主要參數(shù)有打印溫度和打印速率，參數(shù)的設(shè)定關(guān)系到模板打印能否成功和成品支架的形態(tài)。圖1A顯示焦糖墨水可以在高溫下被順利擠出形成纖維，并在3D打印機的控制下進行排列，溫度降低后焦糖墨水很快凝固，所打印的形狀能很好保持。如圖1B所示，3D打印的蔗糖模板具有精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)，為直徑400～600 μm的焦糖絲連續(xù)均勻地堆積而成，層與層之間晶絲交叉粘接形成整體。

圖1C展示了管道內(nèi)部相互連通，提供管道之間的物質(zhì)運輸通道，這種多級管道結(jié)構(gòu)模擬了血管在組織中的運輸功能。采用4%PCL澆筑法能夠制得厚度適中、均勻完整的三維支架(見圖1D)。支架管路排列整齊，分布均勻，縱橫交錯。圖1E～1G顯示，由于蒸餾水滴加于支架一側(cè)，支架的溶解從接觸蒸餾水一側(cè)開始，并逐漸向另一側(cè)發(fā)展。隨著溶解時間的增長，蒸餾水與蔗糖之間的固液界面不斷向支架內(nèi)部推移?？梢杂^察到蔗糖已溶解的部分呈白色管狀支架，而蔗糖未溶解的支架部分呈淺黃色，蔗糖支架內(nèi)的氣泡也隨著溶解向外部遷移。上層支架內(nèi)蔗糖溶解的同時，下層支架內(nèi)的蔗糖也在溶解，當(dāng)所有蔗糖全部溶解時，支架所形成的孔道結(jié)構(gòu)與原有的模板形態(tài)結(jié)構(gòu)完全一致。

圖1 PCL多層管道支架制作過程及結(jié)構(gòu)特點(標(biāo)尺為500 μm)

2.2 PCL多級管道支架縮小SD大鼠梗死面積及瘢痕面積

術(shù)后28 d收集各組SD大鼠心臟組織，進行Masson染色，每組8個樣本。3組切面Masson染色整體及局部代表圖見圖2。Sham組心肌組織無明顯的纖維化；MI組術(shù)后28 d梗死區(qū)域纖維化明顯, 梗死范圍比例為(64.63±7.72)%，瘢痕面積為(13.85±1.98)mm2；MI+scaffold組梗死區(qū)域纖維化較MI組少，梗死范圍為(42.01±8.68)%，瘢痕面積為(9.82±1.47)mm2，與MI組相比均存在明顯差異(P<0.01)。

2.3 PCL多級管道支架促進心肌再血管化

圖3中A和B分別表示MI組和MI+scaffold組心肌梗死交界區(qū)血管再生情況，綠色熒光代表α-SMA，標(biāo)記平滑肌細(xì)胞，紅色熒光代表CD31，標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，藍色熒光代表DAPI，標(biāo)記細(xì)胞核。對比兩者結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI+scaffold組梗死交界區(qū)新生血管密度為(15±3.13)個/HPF，而MI組梗死交界區(qū)新生血管密度為(5.29±0.91)個/HPF，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明PCL多級管道支架對梗死交界區(qū)具有較強的促血管化的能力。圖3表示MI+scaffold組支架內(nèi)血管再生情況。PCL多級管道支架內(nèi)部的新生血管密度為(17.7±2.71)個/HPF，與另兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明PCL多級管道支架具有良好的生物相容性，并具有促血管再生的能力。

圖2 術(shù)后28 d心肌組織Masson染色

注：A為MI組梗死交界區(qū)；B為MI+scaffold組梗死交界區(qū)；C為MI+scaffold組支架內(nèi)部

3 討論

我們通過3D打印技術(shù)，成功制備PCL多級管道支架，并移植于SD大鼠梗死心肌表面，發(fā)現(xiàn)其可縮小心肌梗死范圍和瘢痕區(qū)域，并促進交界區(qū)域的再血管化，從而修復(fù)梗死后的心肌。

目前，心肌補片支架因其在力學(xué)性能上的優(yōu)越性，在梗死后心肌修復(fù)方面取得了較好的成果[7]。然而，大多研究主要關(guān)注補片支架的力學(xué)性能，在其生物相容性和促血管化方面仍然面臨很大的挑戰(zhàn)[8]。3D打印技術(shù)能準(zhǔn)確設(shè)計和調(diào)控支架結(jié)構(gòu)，在心肌補片支架方面應(yīng)用廣泛。

本研究采用3D打印構(gòu)筑三維結(jié)構(gòu)仿生血管網(wǎng)絡(luò)。受限于現(xiàn)有設(shè)備的精度和材料流動加工過程中的變形性，3D打印技術(shù)尚無法直接打印薄壁血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此采取間接倒模的方式來制備血管網(wǎng)絡(luò)支架。利用間接倒模法制備三維支架已經(jīng)取得一定的成果，但仍然面臨一定的挑戰(zhàn)，包括材料的選擇、三維支架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、生物相容性及可降解性[9-10]。我們選擇食用級的蔗糖作為原料，利用熔融層積成型技術(shù)打印支架的模板。模板的形態(tài)結(jié)構(gòu)可以通過3D打印實現(xiàn)宏觀和微觀層面上個性化的定制。焦糖化的蔗糖具有諸多優(yōu)點：良好的生物相容性、原料的易得性、適宜的熔點、熔融狀態(tài)下良好的流動性和降溫時快速的固化成型性。采用液澆鑄和模板浸出法，將生物材料制備成三維連通的管狀網(wǎng)絡(luò)支架，并通過調(diào)控相分離在支架管道壁上形成均勻分布的微納米級的開放孔，模擬天然血管壁的通透性，保證氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)能夠通過管壁，使仿生血管網(wǎng)具備類似血管壁的物質(zhì)交換功能。該巧妙的多級管道結(jié)構(gòu)有利于血管的生長。

心臟發(fā)生心肌梗死后，隨著病情的進展，心臟左室發(fā)生不良的左室重構(gòu)，即心臟左室擴大，膠原纖維沉積，瘢痕形成，最終導(dǎo)致心力衰竭，故逆轉(zhuǎn)不良的左室重構(gòu)對于梗死后心肌修復(fù)至關(guān)重要[11]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，PCL多級管道支架移植于SD大鼠梗死心肌表面28 d后，MI+scaffold組梗死范圍和瘢痕區(qū)域明顯小于MI組，說明PCL多級管道支架在一定程度上能促進心肌修復(fù)。心肌再血管化在心肌修復(fù)中起重要作用，早期再血管化有助于梗死交界區(qū)處于缺血的心肌獲得足夠的血供，防止其因長期的缺血而導(dǎo)致凋亡[12]。本研究中，PCL多級管道支架中長入大量的新生血管，同時梗死交界區(qū)也有大量的新生血管，為處于缺血的心肌細(xì)胞提供了良好的血供，減少梗死交界區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡，故最終可縮小梗死范圍和瘢痕面積，這與組織學(xué)結(jié)果相符。

我們通過3D打印技術(shù)成功制備PCL多級管道支架，經(jīng)動物實驗證實可促進梗死心肌再血管化，縮小梗死范圍和梗死面積，達到修復(fù)心肌的作用。