藍(lán)莓根際土壤真菌多樣性及根腐病拮抗菌的篩選

侯 瑞 王永燦 徐芳玲

( 貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

藍(lán)莓（Vaccniumsp.）為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）多年生常綠或落葉灌木，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值[1]。由麗赤殼屬（Calonectria）、鐮孢屬（Fusarium）真菌引起的藍(lán)莓根腐病是藍(lán)莓主產(chǎn)區(qū)的重要病害。病原菌通過土壤進(jìn)行傳播，侵染藍(lán)莓后可導(dǎo)致全株死亡[2-3]。貴州省藍(lán)莓根腐病由尖鐮孢菌（F. oxysporum）引起[4]，主要依靠傳統(tǒng)的化學(xué)防治，對藍(lán)莓果實品質(zhì)會造成一定影響。因此，尋找環(huán)境中有益微生物是目前防治藍(lán)莓根腐病的發(fā)展方向[5-6]。

土壤真菌多樣性對植物的生長以及生態(tài)系統(tǒng)平衡等方面都起著重要作用[7-8]，植物根際土壤真菌多樣性改變，會影響植物的抗病性[9]。不同植物根際真菌土壤間差異較大[10-11]，目前已有較多的根際土壤真菌用于生物防治，防治效果優(yōu)于化學(xué)試劑[12-13]。本研究對藍(lán)莓根際土壤進(jìn)行分離培養(yǎng)，分析其多樣性，同時篩選藍(lán)莓根腐病拮抗真菌，為藍(lán)莓根腐病生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

于2017年4—7月，選擇貴陽麻江縣藍(lán)莓種植基地（東經(jīng) 107°43′07″、北緯 26°25′49″）藍(lán)莓發(fā)病區(qū)附近健康藍(lán)莓植株，利用抖根法獲得根際土壤樣品，該基地藍(lán)莓根腐病發(fā)生率為18.5%左右。根際土壤樣品沿等高線分別設(shè)置5個樣地（5 m×5 m），在各樣方隨機(jī)選擇8株土壤樣品采集[14]。土壤樣品裝入無菌袋，便攜式低溫保溫箱中帶回實驗室，冰箱低溫保存（4 ℃）。

1.2 根際土壤真菌的分離培養(yǎng)

1.2.1 供試培養(yǎng)基

藍(lán)莓根際土壤真菌的分離和純化采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）、馬丁氏培養(yǎng)基（Martin）和孟加拉紅培養(yǎng)基（PDAm）。

1.2.2 土壤真菌的分離培養(yǎng)

5個樣地采集到的根際土壤等量混合作為供試土壤。采用平板稀釋法，將土壤樣品稀釋至10-2倍，靜置5 min后選取200 μL上清液在PDA、Czapek、Martin和PDAm中進(jìn)行涂布，每種培養(yǎng)基設(shè)置10個重復(fù)。利用菌絲末端挑取法，分別挑取4種不同平板培養(yǎng)基中生長形態(tài)差異典型[15-16]的真菌菌株轉(zhuǎn)接至PDA，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱（黑龍江東拓儀器有限公司，中國）培養(yǎng)，純化3～5次。

1.3 真菌鑒定

1.3.1 土壤真菌的鑒定

使用CTAB提取法，并參考侯瑞[17]的方法提取土壤真菌DNA。利用真菌鑒定通用擴(kuò)增引物ITS1和ITS4，土壤真菌菌株rDNA -ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化參考王娜等[10]的方法，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送測試公司切膠、純化和測序。所有土壤真菌的測序片段修正后，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTN對測序序列進(jìn)行對比分析。

根際土壤中每克干土中的真菌數(shù)量=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土質(zhì)量(g)。按公式（1）～（3）計算Shannon-Wiener真菌多樣性指數(shù)（H）、Pielou真菌均勻度指數(shù)（J）和Margalef豐富度指數(shù)（M）[18-19]。

式中：Pi為第i種的多度比例，S為屬i所在根際土壤中屬的數(shù)目，N為菌落數(shù)量之和。

1.3.2 藍(lán)莓拮抗真菌鑒定

采用平板對峙法測定各分離菌株對藍(lán)莓根腐病菌尖鐮孢菌（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實驗室提供）的抑菌活性。在無菌條件下，利用打孔器（6 mm）選取活化于PDA中的分離菌株和病原菌邊緣新鮮菌絲，分別接種于90 mm PDA兩側(cè)，使得分離菌株和病原菌接種點直徑相距50 mm，只在平板右側(cè)接種病原菌為對照（CK）。設(shè)置3個重復(fù)，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱（RH=40%）中培養(yǎng)7 d。測量CK病原菌菌落直徑和處理組病原菌菌落直徑，按公式（4）計算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根際土壤真菌多樣性指數(shù)和抑菌率測定的數(shù)據(jù)采用Excel 2010和DPS v17.10軟件進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤真菌種類鑒定和分離頻率

由表1可知，利用平板稀釋法共分離獲得的菌落形態(tài)具有明顯差異的真菌80株。通過rDNAITS序列進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)，80株真菌分別隸屬6個綱6個目11屬51種，這些菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知真菌rDNA-ITS序列相似性都達(dá)到了99%和100%，同源性非常高。在分離得到的80株真菌中，青霉屬（Penicillium）14種、木霉屬（Trichoderma）13種、鐮孢屬（Fusarium）7種、孢球托霉屬（Gongronella）5種，籃狀菌屬（Talaromyces）3種、擬青霉屬（Purpureocillium）3種、毛殼屬（Chaetomium）2種，毛霉屬（Mucor）2種、曲霉屬（Aspergillus）、粘帚霉屬（Gliocladium）、擬小球殼孢屬（Microsphaeropsis）各1種。其中，青霉屬分離得到的菌株數(shù)量最多，為藍(lán)莓根際土壤真菌群落的優(yōu)勢屬，占菌株總數(shù)的27.50%。子囊菌門中，木霉屬和鐮孢屬次之，均占菌株總數(shù)的16.25%?；@狀菌屬、毛殼屬均占菌株總數(shù)的5.00%。粘帚霉屬、擬青霉屬和曲霉屬分離得到菌株數(shù)相同，各占總菌株數(shù)的3.75%。小球殼孢屬只分離得到1株，占總菌株數(shù)的1.25%。接合菌門的孢球托霉屬分離得到13株，同樣為優(yōu)勢屬，分離頻率為16.25%。毛霉屬真菌分離得到2株，分離頻率為2.50%。

表1 分離藍(lán)莓根際土壤真菌的rDNA-ITS序列相似性分析Table 1 Similarity analysis of partial rDNA-ITS sequences from rhizosphere soil fungi isolates from Vaccnium sp.

續(xù)表1

續(xù)表1

由圖1可知，不同培養(yǎng)基分離得到的真菌數(shù)量和真菌屬的數(shù)量也不同。其中，PDA和PDAm分離得到的真菌數(shù)量為26株和19株，真菌屬的數(shù)量最多，共8屬。Czapek次之，分離到19株真菌、6個真菌屬的類群。Martin分離得到16株真菌、5個真菌屬，但其分離得到接合菌門孢球托霉屬的真菌數(shù)量最多，其余培養(yǎng)基均是青霉屬或木霉屬的真菌數(shù)量最多。

圖1 藍(lán)莓根際土壤真菌菌群的分離頻率Fig. 1 The isolation frequency of rhizosphere soil fungi from Vaccnium sp.

2.2 根際土壤真菌的多樣性分析

由表2可知，藍(lán)莓植株根際土壤中的真菌數(shù)量總數(shù)為2.96×105cfu/g，H為2.046 1，J為2.282 0，M為0.853 3。

表2 藍(lán)莓根際土壤真菌多樣指數(shù)Table 2 The diversity index of rhizosphere soil fungi of Vaccnium sp.

2.3 根際土壤真菌對藍(lán)莓根腐病病原菌的抑制效果

由表3可知，TP1、TPM1、TM1、TC1等80個菌株與藍(lán)莓根腐病病原菌在PDA中對峙培養(yǎng)7 d后，藍(lán)莓根腐病病原菌菌落生長直徑與CK直徑差異均顯著（P＜0.05）。其中，抑制率在50%以上的菌株有22株，抑制率在70%以上的有 8株，分別是 TP6、TP14、TP16、TPM3、TPM8、 TPM24、 TM11、 TM23。其 中 ，TPM8、TPM24和TM23均屬于日本曲霉（Aspergillus japonicas），TP6、TP14、TP16、TPM3、TM11 則為木霉屬真菌，棘孢木霉（Trichoderma asperellum）TM11明顯抑制病原菌的生長，抑制率達(dá)到79.66%，長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）TP6，木霉屬NECC40034TP14，蓋姆斯木霉（Trichoderma gamsii）TP16，擬康寧木霉（Trichoderma koningiopsis）TPM3的抑制率也均為70%以上。藍(lán)莓根腐病菌與6株土壤根際真菌對峙培養(yǎng)形成的菌落見圖2，根際土壤真菌均抑制了病菌生長。

表3 藍(lán)莓根際土壤真菌抑制效果Table 3 The inhibition effects of Vaccnium sp. rhizosphere soil fungi

續(xù)表3

圖1 藍(lán)莓根腐病菌與土壤根際真菌對峙培養(yǎng)形成的菌落Fig. 2 Colonies on dual-cultured plates between Fusarium oxysporum strain and rhizosphere soil fungi

3 結(jié)論與討論

有關(guān)藍(lán)莓根際土壤真菌研究的較少。雖然藍(lán)莓為栽培種植，但了解藍(lán)莓根際土壤真菌多樣性對其土壤真菌種群特性研究具有重要意義。本研究從藍(lán)莓根腐病發(fā)生區(qū)附近健康藍(lán)莓根際土壤中分離得到的真菌，主要屬于青霉屬（27.50%）、木霉屬（16.75%）、鐮孢屬（16.75%）、孢球托霉屬（16.75%），籃狀菌屬（5%）、曲霉屬（3.25%）和小球殼孢屬（1.25%）等，與研究的其他物種根際土壤真菌相近[20-21]。藍(lán)莓根際土壤真菌的優(yōu)勢屬與其他物種根際土壤的優(yōu)勢種群相似，但在種群組成上存在一定差異，可能是由于藍(lán)莓菌根菌的存在所致[22]。

藍(lán)莓根際土壤中分離獲得的80株真菌對藍(lán)莓根腐病病菌抑制效果，抑制率在70% 以上的有8株，其中，3株均屬于曲霉屬，木霉屬有5株。曲霉屬真菌主要為工業(yè)用途，用于生防的研究并不多，但叢銘等[23]發(fā)現(xiàn)黑曲霉可以防治煙草青枯病。木霉屬真菌主要用作生防，5株木霉分別鑒定為棘孢木霉、長枝木霉、蓋姆斯木霉，擬康寧木霉和未知木霉屬，已知的4種木霉都曾被報道用于生防，對三七灰霉病菌（Botrytis cinerea），花生菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum），立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和尖鐮孢菌有很好的防治效果[24-27]。其次，本研究還發(fā)現(xiàn)金色毛殼屬（Chaetomium aureum）TPM21、TP10、TP13菌株可以產(chǎn)生紅色素，因為其生長速度較慢，所以抑制率并不高，但其產(chǎn)生紅色素后，根腐病病原菌生長會被抑制，與滕懷麗[28]研究金色毛殼真菌具有抑菌活性相似，后期會做進(jìn)一步研究。本研究通過對藍(lán)莓根腐區(qū)附近健康藍(lán)莓根際土壤真菌的分離、鑒定和篩選，獲得了藍(lán)莓根際生防真菌，但生防真菌如何大量定殖于藍(lán)莓根部，使植株免遭病原菌侵染危害，是后期研究需要解決的問題。