遮蔭和氮素添加對芒萁光合特性與抗氧化酶活性的影響

王佳佳 張明如 高 磊 金 迪 何云核

( 1. 浙江農(nóng)林大學風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 杭州 311300)

自然條件下植物的生長發(fā)育速率和生理代謝過程取決于生境的質(zhì)量[1]。光強、氣溫、相對濕度和土壤水分、養(yǎng)分等是決定生境質(zhì)量的重要生態(tài)因子。其中，光照強度直接影響植物的光合速率[2-3]；土壤氮含量限制陸生植物的生長[4-5]。一般的，植物對光強有一定的適應(yīng)范圍，過弱或過強的光都會傷害植物、降低光化學效率，產(chǎn)生光抑制等[6]。徐祥增等[7]研究發(fā)現(xiàn)過度遮蔭會造成三七（Panax notoginseng）光合能力明顯降低，高光同樣會引發(fā)三七的光氧化傷害，姜英等[8]研究紅錐（Castanopsis hystrix）幼苗得出強光生境對其生長及光合作用有一定負效應(yīng)的結(jié)論，周憶堂等[9]研究發(fā)現(xiàn)重度弱光脅迫嚴重影響長春花（Catharanthus roseus）葉片的光合作用。植物氮素參與光合色素、光合酶等物質(zhì)的組成和分配，間接影響植物光合作用[10]；同時，光強也影響葉片氮素的含量及在各組分中的分配[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)施氮顯著提高玉米（Zea mays）生育后期葉片葉綠素含量和氮代謝關(guān)鍵酶活性[12]，增施氮肥可以緩解弱光脅迫對冬小麥（Triticum aestivum）光合作用造成的不利影響[13]，然而植物的碳氮代謝相互關(guān)聯(lián)[14]，只有維持氮素和光強平衡協(xié)調(diào)的供應(yīng)水平，才能發(fā)揮最佳的生態(tài)耦合效應(yīng)，獲得植物最佳的生長狀態(tài)[15]。

芒萁（Dicranopteris dichotoma）為里白科（Gleicheniaceae）芒萁屬（Dicranopteris）多年生常綠蕨類植物，屬于偏陽性草本植物[16-17]。有研究表明，蕨類植物芒萁氣孔的形態(tài)特征對光強的降低響應(yīng)更敏感，因而能夠廣泛分布于林緣等開闊生境[18]。芒萁被認為是亞熱帶低山丘陵區(qū)次生植被的“標志種”植物[19]，自然條件下生長分布于疏灌草叢、林緣以及馬尾松杉木暖性針葉林下層等多種光環(huán)境，經(jīng)常形成連續(xù)密布的單優(yōu)草本層片[20]。與次生裸地相比，在森林植被恢復(fù)的過程中，芒萁的覆蓋有助于增加土壤含氮量，有利于退化裸地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)[21]。然而芒萁能夠定居于異質(zhì)資源的多種生境，可能與其較強的生理代謝調(diào)節(jié)能力有關(guān)。因此，為了了解次生森林植被的多種光環(huán)境與土壤含氮量的變化對芒萁光合生理代謝速率的影響，芒萁調(diào)節(jié)自身的光合生理過程來適應(yīng)光強與氮素的聯(lián)合變化，本研究模擬強、中和弱光環(huán)境，并進行氮素添加與否的處理，探究光強和氮素添加與否對芒萁光合參數(shù)和抗氧化保護酶活性所產(chǎn)生的生態(tài)影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年5月4日至9月30在浙江農(nóng)林大學東湖校區(qū)（119°42′E，30°14′N）進行，芒萁采自浙江省杭州市臨安區(qū)玲瓏山（119°43′35″E，30°15′28″N）。試驗采用盆栽法，選擇芒萁克隆分株苗1株并保留10 cm左右的根狀莖，栽植于40 cm×21 cm×17 cm的長方形花盆內(nèi)，盆栽基質(zhì)為V（芒萁地段表土）∶V（泥炭土）∶V（珍珠巖）=8∶1∶1混勻而成，將栽植的芒萁放置在3層遮蔭大棚緩苗15 d。

1.2 試驗方法

于2018年5月20日選擇長勢良好且形態(tài)基本一致的盆栽芒萁隨機分成6組，每組10盆，分別放置于3個遮蔭棚內(nèi)，每個棚內(nèi)2組，分別進行施氮（N1）和不施氮處理（N0）。遮蔭棚分別為覆蓋 1層（L1）、2層（L2）、3層（L3）黑色尼龍遮陽網(wǎng)，選擇3個晴天的8：00—18：00利用DRM-FQ光量子儀（Apogee Instruments，美國）測定3個遮蔭棚內(nèi)的光量子通量密度，每個棚選擇3個測定點，每個點測定10組數(shù)據(jù)，求取平均值，計算得到與全光相比透光率分別為35.96%、13.00%、4.75%。施氮量根據(jù)前人的研究[22]，綜合調(diào)整本研究盆栽氮素所需量，每盆施0.6 g純氮，即3 g（NH4）2SO4分析純?nèi)芙庥?00 mL純水中，均勻噴入盆內(nèi)土壤表面，未施氮組噴入等量的水。生長期間適當澆水以保證芒萁不受干旱影響。

1.3 測定方法

1.3.1 光響應(yīng)進程的測定

利用Li-6800便攜式光合作用測定系統(tǒng)（Li-COR，美國）測定光合氣體交換參數(shù)及光響應(yīng)進程。選擇晴天上午8：00—11：00，于2018年7月29日開始測定，每組處理選取3盆，每盆重復(fù)測定3次，選擇成熟的功能葉片進行測定，取平均值。測定選擇儀器自帶的紅藍光源葉室，葉室溫度設(shè)定為（25±0.5）℃；CO2濃度設(shè)置為 400 μmol/mol，氣體流速為500 μmol/s，光強梯度即光合有效輻射（PAR）為 2 000、1 500、1 200、1 000、800、500、300、100、50、30、 10、 0 μmol/（ m2·s），測定凈光合速率（Pn）；利用光響應(yīng)測定數(shù)據(jù)進行芒萁氣體交換特征，包括蒸騰速率（E）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci），借助直角雙曲線修正模型[23]擬合光響應(yīng)模型，根據(jù)模型計算最大凈光合速率（Pnmax）、光飽和點（LSP）、光補償點（LCP）、表觀量子效率（AQY）和暗呼吸速率（Rd）。

1.3.2 丙二醛及保護性酶活性的測定

采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量；紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性；愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性；采用SOD試劑盒測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素和LSD法進行方差分析和多重比較,得到不同處理下各參數(shù)的平均值、標準誤及在P=0.05水平上的差異顯著性；采用雙因素方差分析檢驗光強、氮素及其交互作用對光響應(yīng)特征參數(shù)和抗氧化酶活性的影響。利用Origin Pro 8.0軟件對光響應(yīng)參數(shù)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同遮蔭與氮素添加對芒萁光響應(yīng)特征的影響

2.1.1 不同遮蔭與氮素添加光響應(yīng)曲線的變化

由圖1 可知，當 PAR＜100 μmol/（m2·s）時，芒萁Pn呈線性增加，各處理下芒萁Pn均非常接近。當 PAR 增加至 500 μmol/（m2·s）時，各處理組芒萁Pn增加緩慢。在未施氮組各遮蔭條件下，芒萁在 PAR=500 μmol/（m2·s）時Pn出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；而施氮組各遮蔭條件下芒萁葉片Pn在 PAR=300 μmol/（m2·s）時出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。當 PAR＞500 μmol/（m2·s）時，除 L3外，L1、L2的Pn均隨PAR的增加至飽和點后出現(xiàn)下降趨勢。由此說明，PAR達到飽和后，L1、L2葉片光合作用出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象。L1、L2下施氮處理與未施氮處理大小變化均為N1＞N0，L3條件下施氮處理與未施氮處理大小變化表現(xiàn)為N1＜N0。

圖1 不同遮蔭和氮素添加芒萁光合作用-光響應(yīng)曲線的變化Fig. 1 Changes in photosynthesis-photoresponse curves of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

2.1.2 不同遮蔭和氮素添加對E和Gs的影響

由圖1可知，各處理的E在 PAR=0 μmol/（m2·s）時表現(xiàn)明顯的大小差異。PAR＞0 μmol/（m2·s）時，隨PAR的增加E上升。E隨遮蔭程度的增加大小表現(xiàn)為L2＞L1＞L3。施氮處理后各遮蔭條件下E均下降，但隨PAR的增加而增加，且L1、L2極為相近。Gs隨PAR變化復(fù)雜，各遮蔭處理下Gs均上升緩慢且變化不一。PAR＜100 μmol/（m2·s）時，未施氮處理組，L1的Gs隨 PAR 的增加而增加，PAR＞100 μmol/（m2·s）時，Gs幾乎不增加且趨于穩(wěn)定；L2的Gs隨PAR的增加而緩慢增加，至 PAR=1 500 μmol/（m2·s）后出現(xiàn)略微下降；L3的Gs隨PAR的增加先上升，至 100 μmol/（m2·s）后呈下降趨勢。施氮處理組與未施氮處理組相比，各光強處理下芒萁葉片Gs均下降，且L2下Gs下降幅度小于L1、L3。L1遮蔭條件下施氮處理組與未施氮處理組相比下降幅度為4.6%～25.0%，L2降低幅度為0.4%～4.0%，L3降低幅度為26.6%～40.8%。

圖1 不同遮蔭和氮素添加對芒萁E和Gs的光響應(yīng)變化Fig. 2 Photoresponse changes of transpiration rate and stomatal conductance of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

2.1.3 不同遮蔭和氮素添加對Ci的影響

由圖3 可知，當 PAR＜100 μmol/（m2·s）時，不同遮蔭條件下芒萁Ci下降迅速，而后下降緩慢。與光合—光響應(yīng)變化相似，前期光合速率迅速上升，表現(xiàn)為Ci消耗增加即Ci迅速下降，而后趨于穩(wěn)定，Ci下降變緩。施氮處理后，各光強下Ci的大小差異明顯，且 PAR＜500 μmol/（m2·s）時，Ci的下降較快，說明氮素的輸入對芒萁利用CO2的能力有一定影響，最明顯的是對弱光下CO2的利用速率。施氮處理后L1、L3的Ci下降，L2的Ci上升。

圖3 不同遮蔭和氮素添加芒萁胞間CO2濃度的光響應(yīng)變化Fig. 3 Photoresponse changes of intercellular CO2 concentration of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

2.2 光強和氮素添加對芒萁葉片光合-光響應(yīng)特征參數(shù)的影響

由表1可知，隨遮蔭的增加芒萁葉片Pnmax和LSP均表現(xiàn)為先升后降，且均在L2下出現(xiàn)最大值，L3下出現(xiàn)最小值。隨遮蔭程度增加LCP下降，AQY增加且顯著高于L1、L2（P＜0.05）。芒萁Rd差異不顯著，L3下均出現(xiàn)最小值。施氮處理后，L1、L2下芒萁Pnmax增加了13.9%、11.0%，LSP分別增加了12.2%、8.2%，L3下Pnmax和LSP分別下降了17.1%、12.6%，各遮蔭條件下芒萁LCP均有所下降但差異不顯著，AQY均有所上升，L1、L3下芒萁Rd下降，L2上升但差異不顯著。未施氮處理組，L1、L2、L3下光能利用范圍分別為22.4～1 078.8、19.2～1 138.7、13.1～950.3 μmol/（m2·s），施氮處理組光能利用范圍分別為19.8～1 210.2、19.1～1 232.6、8.0～830.6 μmol/（m2·s），施氮組L1、L2下芒萁光能利用范圍增加了12.7%、8.4%，L3下芒萁光能利用范圍下降了12.2%。

表1 不同遮蔭和氮素添加與否芒萁光合光響應(yīng)特征參數(shù)的變化Table 1 Changes in photosynthetic response parameters of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

由表2可知，遮蔭對Pnmax、LSP、LCP、AQY均具有極顯著性影響（P＜0.01），氮素對各光合特征參數(shù)均無顯著性影響，僅LSP受到遮蔭和氮素的交互顯著影響（P＜0.01）。由此說明，氮素的施加可緩解遮蔭對芒萁光合特征參數(shù)的影響。

表2 光強、氮素及其交互作用對芒萁光合特征參數(shù)影響的效應(yīng)分析Table 2 Effect of light intensity, nitrogen and their interaction on photosynthetic parameters of D. dichotoma

2.3 遮蔭和氮素添加對MDA含量和保護酶活性的影響

由表3可知，未施氮處理組，隨遮蔭的增加，L3下 MDA 含量顯著高于 L1、L2（P＜0.05）。SOD活性隨光強的降低表現(xiàn)為先升后降，且各遮蔭條件下SOD活性差異顯著（P＜0.05）。CAT活性隨光強的降低而增加，表現(xiàn)為L3顯著高于L1、L2（P＜0.05）。POD 活性隨光強的減弱表現(xiàn)為先降后升且L3顯著高于L1、L2（P＜0.05）。施氮處理組，L1下MDA含量顯著下降（P＜0.05），SOD、CAT、POD活性上升。L2下MDA含量、SOD活性、CAT活性、POD活性均顯著上升（P＜0.05）。L3下MDA含量下降但差異不顯著，SOD活性、CAT活性、POD活性均顯著降低（P＜0.05），與未施氮相比分別下降了1%、9%、21.2%、60.3%。

表3 不同遮蔭和氮素添加對芒萁MDA和保護酶活性的影響Table 3 Changes of malondialdehyde and protective enzyme activities of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

由表4可知，遮蔭、氮素及其交互作用對芒萁MDA含量和抗氧化酶活性均有極顯著性影響（P＜0.01），從F值判斷，氮素的添加可以降低MDA含量，SOD活性也降低，但CAT和POD活性均得到提高。

表4 光強、氮素及其交互作用對芒萁MDA和抗氧化酶活性影響的效應(yīng)分析Table 4 Effect of light intensity, nitrogen and their interaction on the activity of malondialdehyde and antioxidant enzymes

3 結(jié)論與討論

光照強度和氮素營養(yǎng)是植物生長發(fā)育的重要限制因子。本研究中除Rd外，其他光合特征參數(shù)均受光強的極顯著性影響，氮素對其影響均不顯著，表明芒萁的生長受光強的影響比氮素營養(yǎng)大，這與De Pinheiro等[25]對萵苣（Lactuca sativa）的研究結(jié)果相似。植物長期適應(yīng)不同光環(huán)境，產(chǎn)生一定的適應(yīng)對策，形成喜陰或喜光特性[26]。Pnmax反映植物潛在的光合能力，Pnmax越大說明植物光合能力越強[27]。本研究中，芒萁在L2遮蔭下具有強的光合作用能力和較寬的光能利用范圍，L2遮蔭且施氮條件下對光的可利用范圍達到最大程度。L3遮蔭條件下芒萁顯著降低LCP以提高對弱光的利用能力來適應(yīng)弱光環(huán)境，又表現(xiàn)出一定的耐蔭性。氮素參與植物光合酶的合成過程與活性的維持，從而調(diào)節(jié)光合速率[28]，表觀量子效率AQY越大對弱光的利用能力越強，施氮組芒萁對弱光的利用能力均得到增強，即LCP降低、AQY增加。前人研究證明，合理施氮能提高植物的光合速率[29-32]，而生理可塑性強的植物在遮蔭環(huán)境下可通過降低LCP和LSP增強對弱光的利用能力[33-35]，施氮在一定程度上增大了L1、L2下芒萁對光強的利用范圍，同時增強了L3下芒萁對弱光環(huán)境的適應(yīng)性。施氮降低了L3下芒萁的Pnmax，但同時Rd顯著降低，說明芒萁減少了因呼吸造成的碳消耗，以提高光合產(chǎn)物的積累，維持正常的生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，蕨類植物在較高光強下比低光強下具有更高的光飽和點和光合作用能力[36]，本研究也證明了這一點。

植物對外界環(huán)境快速而靈敏的調(diào)控反應(yīng)主要借助氣孔的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)，通過氣孔為植物提供光合作用原料[37]。研究表明，開闊生境下芒萁氣孔密度較大，氣孔長度小，小而密的氣孔可以使植物獲得更大的氣孔導(dǎo)度和光合速率[18]。本研究在未施氮處理組L3下，Gs隨光合有效輻射增加呈現(xiàn)先增加后下降，可能是芒萁適應(yīng)了強度遮蔭環(huán)境，形成了不同的氣孔形態(tài)、獲得了小的氣孔導(dǎo)度，結(jié)果無法適應(yīng)較大光合有效輻射，因而最終出現(xiàn)Gs下降。施氮處理組隨光合有效輻射增大芒萁Gs呈現(xiàn)緩慢的增加，氣孔平穩(wěn)的進行氣體交換，有利于光合作用的進行，說明施氮對維持各光強下芒萁穩(wěn)定的光合作用能力有一定的促進作用。通常植物光合速率的下降原因分為氣孔限制和非氣孔限制[37-39]。植物處于逆境時，Pn、Gs和Ci同時降低，則是由氣孔限制引起，否則為非氣孔限制，即光合速率的下降由植物葉肉細胞羧化能力的降低所引起。本研究結(jié)果顯示，L3下Pn的降低伴隨著Ci和Gs的下降，說明該環(huán)境下Pn的降低由氣孔限制引起。

在正常情況下，植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當遭受逆境脅迫時，植物體內(nèi)的活性氧積累。為了減輕由于活性氧自由基引發(fā)的膜質(zhì)過氧化傷害，植物將啟動體內(nèi)的保護酶系統(tǒng)[40]。一般的，MDA含量是判斷植物細胞受傷害程度的指標，MDA含量、SOD活性、POD活性和CAT活性同時上升，或者MDA含量下降、SOD活性、POD活性、CAT活性均上升，有利于植物緩解ROS的危害，維持植物正常的生理水平[41]。本研究中，遮蔭、氮素及其交互作用對MDA含量均有極顯著性影響，遮蔭和氮素的交互作用影響程度小于遮蔭，說明氮素營養(yǎng)的輸入一定程度上可降低芒萁受光脅迫的傷害。芒萁在L3下MDA含量顯著高于L1、L2，說明其受膜質(zhì)過氧化傷害最嚴重，但其啟動保護酶系統(tǒng)，提高SOD、CAT、POD活性，以歧化自由氧離子，從而誘導(dǎo)清除酶的清除。L2下芒萁光能利用范圍最大，而進行光合作用的細胞器葉綠體是產(chǎn)生活性氧的主要場所，無論是銨態(tài)氮的同化還是硝態(tài)氮的還原，均需要光合作用產(chǎn)生的能量[42]。因而，氮素的輸入提高光能利用范圍的同時不可避免的對活性氧水平及抗氧化酶活性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致L2下MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性顯著性升高。而L1下MDA含量顯著降低，可能是SOD、POD、CAT活性的增加，起到了清除作用。

植物必需資源的分布具有時空異質(zhì)性，常常呈現(xiàn)為“資源交互斑塊性”特征[43]，亞熱帶低山丘陵區(qū)資源分布表現(xiàn)為暖性單優(yōu)針葉群落下層弱光生境和養(yǎng)分豐富的土壤，而群落外緣則為強光生境伴隨土壤貧瘠化。芒萁從弱光生境到強光生境均表現(xiàn)很強的生理可塑性，即強光下高的Pn和LSP、弱光下LCP和Rd低，因此芒萁在各種光環(huán)境條件下均能保持較高的生態(tài)適合度[44]。生境資源豐富能加速植物的定居擴散。施氮對芒萁光合作用能力及在弱光環(huán)境下的適應(yīng)性均有一定促進作用，因此土壤肥力對芒萁在野外不同光環(huán)境下定居擴散并形成單優(yōu)草本層片的現(xiàn)象有一定影響。至于何種范圍的氮素變化對芒萁生長影響最大，以及芒萁作為為典型的根狀莖克隆植物如何調(diào)節(jié)母株—分株系統(tǒng)應(yīng)對環(huán)境資源變化，仍需要做進一步的研究。

由此可見，13.00%透光條件下更適合芒萁的生長發(fā)育，具有較高的光合作用潛能，隨遮蔭的增加，芒萁通過調(diào)節(jié)對弱光的利用能力適應(yīng)遮光生境，表現(xiàn)出一定的耐蔭性；L3下芒萁受光脅迫最嚴重，但其抗氧化保護酶活性顯著上升，表現(xiàn)出一定的清除能力；遮蔭是影響芒萁光合特征參數(shù)的主要因子，而MDA含量及抗氧化酶活性均受遮蔭、氮素及其交互作用的顯著性影響。