厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中喹啉與吲哚共基質(zhì)的降解特性

高艷娟,岳秀萍,段燕青,張智春,張 瀟,羅艷紅

厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中喹啉與吲哚共基質(zhì)的降解特性

高艷娟,岳秀萍*,段燕青,張智春,張 瀟,羅艷紅

(太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山西 太原 030024)

研究了厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中,典型含氮雜環(huán)化合物喹啉、吲哚作為共基質(zhì)碳源,厭氧生物對二者的降解特性,及群落分析.結(jié)果表明:在共基質(zhì)條件下,喹啉的存在對吲哚的生物降解有抑制作用,且抑制隨喹啉濃度的升高而升高;吲哚的存在對喹啉的生物降解有促進(jìn)作用,但吲哚濃度過高(150mg/L)抑制了喹啉的降解;喹啉、吲哚共基質(zhì)時,二者的降解都遵循零級反應(yīng)動力學(xué);通過GC-MS分析,喹啉的主要中間代謝產(chǎn)物分別為2(1H)喹諾酮與8-羥基-2(1H)喹諾酮;吲哚的主要代謝產(chǎn)物為2-吲哚酮與靛紅;通過高通量測序?qū)不|(zhì)體系的微生物群落進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)厭氧功能菌群得到富集,細(xì)菌菌門以變形菌門Proteobacteria為主,菌綱以Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria為主,菌屬以,,,和為主.

厭氧；反硝化產(chǎn)甲烷；共基質(zhì)；中間產(chǎn)物；微生物群落

含氮雜環(huán)化合物普遍存在于焦化廢水、制藥廢水、染料廢水和農(nóng)藥廢水中,具有致突變性,致癌性,致畸性等特點,是一種難降解的有毒有機(jī)污染物[1],對其無害化處理非常難,如何使其被微生物利用,降低毒性,解決出水水質(zhì)多年來難以達(dá)標(biāo)的難題,一直是工業(yè)廢水處理的熱點. 當(dāng)前,關(guān)于含氮雜環(huán)化合物的處理方法主要有物理化學(xué)法和生物法.物理化學(xué)法的成本過高,且有些方法會造成二次污染,不適用于大量廢水的處理[2].生物法是利用污泥中的微生物進(jìn)行降解,其成本低、管理方便及對有機(jī)物可有效利用[3],其中生物降解中的厭氧耦合反硝化產(chǎn)甲烷技術(shù)由于其較高的降解率,對含氮雜環(huán)化合物的高效處理,且可以在單一反應(yīng)器內(nèi)實現(xiàn)同時除碳脫氮,具有節(jié)約成本,能源回收等優(yōu)點日益被人們關(guān)注[4].

喹啉、吲哚作為典型的含氮雜環(huán)化合物,已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注[1,5].Berry等[6-7]研究了厭氧反硝化情況下,含氮雜環(huán)化合物的生物降解特性,揭示了雜環(huán)化合物的降解途徑.Li等[8]研究了喹啉、吲哚單基質(zhì)在厭氧反硝化下的降解特性,發(fā)現(xiàn)降解速率為吡啶>吲哚>喹啉.國內(nèi)外大部分研究都是用喹啉、吲哚作為單獨(dú)碳源,但在實際廢水中,含氮雜環(huán)化合物通常是以共基質(zhì)的狀態(tài)存在的,了解共基質(zhì)體系中的降解十分重要.Li等[9]研究了在缺氧反應(yīng)器中,利用活性污泥法,在共基質(zhì)條件下,吡啶對吲哚的降解具有促進(jìn)作用.Zhao等[10]利用活性炭的吸附,分析了苯酚與吲哚共基質(zhì)的降解特征,發(fā)現(xiàn)苯酚促進(jìn)了吲哚的降解.但有關(guān)喹啉、吲哚共基質(zhì)間的共代謝作用、兩者降解過程中的相互影響研究報導(dǎo)甚少,且在共基質(zhì)體系中代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、微生物群落結(jié)構(gòu)的特征亟待研究.

因此,本文在厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中,選取喹啉與吲哚共基質(zhì)作為碳源與電子供體,NO3?-N作為電子受體,考察喹啉、吲哚在共基質(zhì)條件下的降解特性和降解動力學(xué)特征,對中間降解產(chǎn)物進(jìn)行分析,且利用高通量技術(shù)研究微生物菌群群落特征,以期為基于厭氧反硝化產(chǎn)甲烷技術(shù)在降解含氮雜環(huán)化合物的實際應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 裝置與材料

實驗采用序批式有機(jī)玻璃反應(yīng)器,容積為500mL,上部設(shè)有取樣口,取樣口用止水夾使其密封.反應(yīng)器放入恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中,進(jìn)行恒溫培養(yǎng),搖床溫度為35℃,轉(zhuǎn)速為40r/min.取樣間隔時間為1d,每次取上清液5mL,以轉(zhuǎn)速10000r/min離心10min后測定喹啉、吲哚的濃度.

實驗接種污泥取自穩(wěn)定運(yùn)行的焦化廢水廠厭氧段污泥(MLVSS=3000g/L),對接種污泥進(jìn)行預(yù)處理,先曝氣1h以上,再用蒸餾水反復(fù)沖洗污泥,將污泥中的雜質(zhì)、無機(jī)物與有機(jī)物去除干凈,再用N2曝氣20min,去除污泥中的溶解氧,使ORP低于-120mV以下.預(yù)處理完后,將污泥與配水以1:3的比例加入到反應(yīng)器中,再用N2曝氣10min,去除溶液中的氧氣.

實驗配水采用人工配水,以喹啉、吲哚作為共同碳源,分2個實驗組,第一實驗組吲哚濃度不變(150mg/L),喹啉濃度遞增:0,50,100,150mg/L;第二個實驗組喹啉濃度不變(150mg/L), 吲哚濃度遞增:0,50,100,150mg/L.每個小組設(shè)置3個平行.以NaNO3為氮源,同時添加微生物生長所必需的微量元素與常量元素.固定NaNO3濃度為30mg/L,投加常量元素KH2PO4、CaCl2、MgSO4,投加量按N:P: Ca:Mg=28:6:1:1[8];投加微量元素的組成與含量(g/L): FeCl2?4H2O(1.422),ZnSO4?7H2O(0.23), CuSO4?5H2O (0.39),CoCl2?6H2O(0.05),NaMoO4(0.23),NiCl2?6H2O (0.081),Na2SeO3(0.011), H3BO4(0.02), EDTA(5), MnCl2?4H2O(0.2).維生素的組成與含量(g/L):生物素(2.00),硫胺素(5.00),鹽酸吡哆醇(10.00),D-泛鈣酸(5.00),硫辛酸(5.00),葉酸(2.00),核黃素(5.00),煙酸(5.00),對氨基苯甲酸(5.00), 維生素B12(0.10).溶液的初始pH用1mol/L NaOH 溶液和 ( 1+9) HCl調(diào)節(jié)到7.0.

1.2 實驗方法

1.2.1 污泥的馴化與測量指標(biāo) 接種污泥在厭氧反應(yīng)器中,經(jīng)過60d的馴化培養(yǎng),每間隔7d換1次水,使喹啉、吲哚的降解率達(dá)到90%以上,反應(yīng)體系基本到穩(wěn)定狀態(tài).此后進(jìn)行喹啉、吲哚共基質(zhì)的降解研究.喹啉、吲哚的測量用液相色譜(HPLC),流動向為甲醇與水(60:40),流動速率為1mL/min,喹啉的測量波長為313nm,吲哚的測量波長為270nm;喹啉的代謝產(chǎn)物2(1H)喹諾酮的測量波長為276nm; 吲哚代謝產(chǎn)物2-吲哚酮的檢測波長是247nm.本實驗所用的藥品均為可購買的分析純藥品.

1.2.2 高通量群落分析 厭氧反硝化產(chǎn)甲烷污泥對喹啉、吲哚的去除率達(dá)到100%后,取接種污泥樣品(S0),共基質(zhì)實驗組中污泥樣品(S1)進(jìn)行高通量微生物群落分析.污泥樣品以12000r/min離心10min,置于-20℃保存以備DNA提取.DNA的提取與PCR的擴(kuò)增均通過上海生工技術(shù)公司進(jìn)行,方法按照之前報道的文章[11],細(xì)菌引物為341F (5′-CCCTACA- CGACGCTC-TTCCGATCTG-3′) and 805R(5′-GA- CTGGAGTTCCTTGGCACC-CGAGAATTCCA-3′).

1.2.3 中間代謝產(chǎn)物分析 采用GC-MS技術(shù)分析吲哚、喹啉降解過程中的代謝產(chǎn)物.GC-MS色譜柱為石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm),GC-MS分析條件:載氣為氦氣,流速為1.0mL/min;進(jìn)樣口溫度為310℃,采用程序升溫,氣化室溫度為100℃保持1min,再以5℃/min 增到210保持2min,采集模式采用全掃檢測模式,范圍為50~600.

2 結(jié)果與分析

2.1 吲哚與喹啉共基質(zhì)條件下降解特性

在厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中,吲哚與喹啉共基質(zhì)時,兩物質(zhì)均能被很好地降解,吲哚(150mg/L)隨喹啉濃度變化(0,50,100,150mg/L)的生物降解情況如圖1(a).由圖1可知,吲哚單基質(zhì)時,其在48h內(nèi)降解完,降解率達(dá)到100%;共基質(zhì)時,當(dāng)喹啉濃度從50mg/L升高到150mg/L,吲哚的降解率從100%降低到92.8%,降解時間從72h 延長到96h.分析得隨著喹啉濃度的提高,喹啉對吲哚的降解產(chǎn)生抑制作用,且濃度越高,抑制作用越強(qiáng),這是由于喹啉的毒性較大[12],喹啉的存在對微生物產(chǎn)生毒性,減弱了菌群對吲哚的利用.

喹啉(150mg/L)隨吲哚濃度變化(0,50,100, 150mg/L)的生物降解情況如圖1(b).分析圖1(b)可知,喹啉單基質(zhì)時,其在72h降解完,降解率達(dá)100%;共基質(zhì)時,吲哚濃度為50,100mg/L,喹啉降解時間減少到60、48h,而吲哚為150mg/L時,喹啉降解時間延長到84h.分析得當(dāng)吲哚低于100mg/L,對喹啉的降解有促進(jìn)作用,且促進(jìn)作用隨濃度的升高而增大,這是由于吲哚的降解速率較快[8],吲哚降解過程中,促進(jìn)了微生物的新陳代謝,增加了生物量,致使喹啉降解速率加快;反之達(dá)到150mg/L時,吲哚對喹啉的降解產(chǎn)生抑制,這由于吲哚過量時,其毒性變大,影響了微生物的活性,降低了喹啉的降解速率.

2.2 喹啉與吲哚共基質(zhì)時降解動力學(xué)方程

喹啉與吲哚共基質(zhì)時的降解速率按零級反應(yīng)進(jìn)行曲線擬合,結(jié)果見表1、2.從表中可以看出,兩者生物降解都遵循零級反應(yīng)動力學(xué).在表1中,吲哚單基質(zhì)時,反應(yīng)速率常數(shù)為3.23mg/(L·h),加入50,100, 150mg/L喹啉后,反應(yīng)速率分別降低到2.31,1.72, 1.43mg/(L·h),進(jìn)一步說明了在共基質(zhì)中,喹啉對吲哚的降解有抑制作用,且這種抑制作用隨喹啉投加量的增加而增大.在表2中,喹啉單基質(zhì)時,反應(yīng)速率常數(shù)為2.32mg/(L·h),而加入50,100mg/L吲哚后,喹啉降解速率加快,反應(yīng)速率常數(shù)顯著增加,升高到2.69, 3.19mg/(L·h),說明了吲哚的存在,對喹啉的降解有促進(jìn)作用;但吲哚濃度升高到150mg/L,喹啉的反應(yīng)速率常數(shù)為1.92mg/(L·h),反映了吲哚濃度過高,促進(jìn)作用消失,對喹啉的降解產(chǎn)生了抑制,這是由于吲哚降解提高了的生物量產(chǎn)生對喹啉降解的促進(jìn)作用,小于過高濃度吲哚對微生物的毒性的抑制作用,導(dǎo)致喹啉降解減慢.結(jié)果與之前研究類似,苯酚濃度的增長(100~200mg/L)促進(jìn)了吲哚中間產(chǎn)物的形成,但是由于苯酚的毒性,過高濃度的苯酚(>200mg/L)反而抑制了吲哚中間產(chǎn)物的產(chǎn)生[13].

表1 吲哚降解隨喹啉濃度變化的動力學(xué)方程

表2 喹啉降解隨吲哚濃度變化的動力學(xué)方程

2.3 喹啉與吲哚共基質(zhì)時的降解產(chǎn)物分析

由GC-MS分析(圖2)可見,在喹啉厭氧降解過程中,·OH攻擊2位生成2(1H)喹諾酮,其繼續(xù)被氧化生成8-羥基-2(1H)喹諾酮.此途徑與Shukla報道的喹啉的降解途徑一致[14],隨后氮雜環(huán)開環(huán),最后被轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水.吲哚在降解過程中,在C-2位與×OH形成中間產(chǎn)物2-吲哚酮,再羥基化形成靛紅,此途徑與Madsen報道的,厭氧反硝化中吲哚降解途徑相似[15],其隨后羧基化形成鄰氨基苯甲酸,最后轉(zhuǎn)化成二氧化碳與水.但是本試驗中并未檢測到2,3-二羥基苯丙酸與鄰氨基苯甲酸,可能與化合物自身的不穩(wěn)定性或者中間代謝產(chǎn)物較快的代謝速率有關(guān).

為了研究共基質(zhì)下中間產(chǎn)物的代謝情況,選取最初的代謝產(chǎn)物2(1H)喹諾酮與2-吲哚酮,分析二者的代謝情況,見圖3.從圖3(a)可見,吲哚的中間產(chǎn)物2-吲哚酮均先升高后降低,隨著喹啉濃度的增高(0~150mg/L),2-吲哚酮積累量增高且降解時間延長,降解速率逐漸變慢(1.87~0.75mg/(L×h)).說明共基質(zhì)時,喹啉抑制了吲哚中間產(chǎn)物的形成和轉(zhuǎn)化.由圖3(b)可見,喹啉的中間代謝產(chǎn)物2(1H)喹諾酮同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,隨著吲哚濃度的增加(0~100mg/L),2(1H)喹諾酮的積累量減少、降解時間縮短及速率加快(1.14~1.45mg/(L×h)),但吲哚增到150mg/L,2(1H)喹諾酮積累量增高,降解速率變慢(0.83mg/(L×h)).說明了適量的吲哚促進(jìn)了喹啉中間產(chǎn)物的形成和降解,提高了中間產(chǎn)物的代謝速率.

圖2 喹啉與吲哚降解過程過程中72h的GC-MS譜圖

圖3 在厭氧反硝化產(chǎn)甲烷條件下,喹啉與吲哚共基質(zhì)時中間產(chǎn)物的形成與降解

2.4 喹啉與吲哚共基質(zhì)下微生物群落分析

選取共基質(zhì)下的厭氧污泥(S1)與接種污泥(S0),進(jìn)行高通量群落分析,微生物的門、綱、屬結(jié)果見圖4.從圖4(a)看出,在厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中,細(xì)菌菌門以變形菌門Proteobacteria為主,這種菌門具有在反硝化過程中,利用硝酸鹽氮為電子受體,降解雜環(huán)化合物的功能[16],在共基質(zhì)污泥體系中, Proteobacteria的相對豐度從32.35%(S0)富集到56.88%(S1),成為喹啉、吲哚共基質(zhì)體系中優(yōu)勢菌門.Chloroflexi是綠彎菌門,它是一種厭氧菌,被普遍發(fā)現(xiàn)存在于厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中,在喹啉、吲哚共基質(zhì)體系中,也占用較高豐度(14.23%).菌門Bacteroidetes是擬桿菌門,研究者發(fā)現(xiàn),擬桿菌門是污水生物處理細(xì)菌菌群的重要組成成分[17]; Acidobacteria是酸桿菌門,據(jù)報道它是厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷體系中的重要菌群[18],在厭氧反硝化產(chǎn)甲烷共基質(zhì)體系中,Bacteroidetes和Acidobacteria 相對豐度均分別從S0中4.73%和1.73%升高到S1中5.85%和3.68%,成為重要菌群.Bacteroidetes和Acidobacteria這兩個菌門可以將喹啉、吲哚等難降解的大分子含氮雜環(huán)化合物轉(zhuǎn)化為小分子等易降解有機(jī)物,例如乙酸、丙酸、戊酸等,容易被菌種利用,進(jìn)而進(jìn)行產(chǎn)甲烷[19].

從圖4(b)中看出,共基質(zhì)體系中,細(xì)菌菌綱以Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria為主,這三個菌綱都屬于變形菌門(Proteobacteria).這類型菌群在厭氧污水處理,污染物的降解與厭氧污泥形成的過程中發(fā)揮著十分重要的代謝功能,適用于降解多環(huán)芳烴等多種有機(jī)物的降解[20].菌綱Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria的相對豐富均分別從11.4%、8.52%(S0)升高到24.16%、16.69% (S1),說明對比接種污泥,經(jīng)過長時間馴化,共基質(zhì)體系中降解喹啉、吲哚的功能菌群得到富集.

對細(xì)菌的菌屬做了進(jìn)一步的分析,結(jié)果見圖4(c).屬于菌綱Gammaproteobacteria,它具有一定的反硝化能力,可將硝酸鹽氮還原為氮?dú)?并且在厭氧污泥中礦化芳香族化合物的功能[21-22],常存在于降解含氮雜環(huán)化合物的厭氧污泥中.據(jù)報道,在合適的生存體系中,可以通過IifC酶對吲哚、喹啉進(jìn)行氧化和降解[21].因此,菌屬成為共基質(zhì)體系中相對豐度最高的功能菌屬,從S0中2.57%升高到S1中15.73%.的相對豐度從0.02%(S0)升高到5.06%(S1),研究發(fā)現(xiàn)具有一定的反硝化功能,被發(fā)現(xiàn)存在于吲哚和喹啉的降解污泥中,可以在反硝化過程中利用硝酸鹽氮作為電子受體,氧化有機(jī)物[23].菌屬的相對豐度升高到3.26%(S1),它常存在于厭氧有機(jī)物降解的污泥中,具有反硝化功能[24],成為共基質(zhì)降解的重要菌屬.菌屬普遍存在于厭氧發(fā)酵污泥中,研究發(fā)現(xiàn)它是一種H2利用細(xì)菌,可以利用丙酮酸、乳酸、甲酸鹽和H2作為電子供體,在發(fā)酵反應(yīng)中產(chǎn)甲烷[25].菌屬從0.34%(S0)增高到1.65% (S1),反映了它利用喹啉、吲哚降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì),進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng),產(chǎn)甲烷的特性.其他功能菌屬如:,等,都具有一定的反硝化,降解有機(jī)物的功能[26],在共基質(zhì)群落中占有十分重要的作用.

(a) 菌門;(b) 菌綱;(c) 菌屬

綜上所述,在厭氧反硝化產(chǎn)甲烷體系中,喹啉、吲哚共基質(zhì)條件下,其微生物種群分屬于菌門Proteobacteria, Chloroflexi, Bacteroidetes和Acidobacteria;菌綱以Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria為主;功能菌屬中最重要的是、、和,其他功能菌屬也在喹啉、吲哚降解中發(fā)揮著重要作用.

3 結(jié)論

3.1 在厭氧反硝化產(chǎn)甲烷共基質(zhì)體系中,喹啉對吲哚的降解產(chǎn)生抑制作用,濃度越高,抑制作用越強(qiáng);吲哚(<100mg/L)對喹啉的降解有一定的促進(jìn)作用,但達(dá)到150mg/L后,促進(jìn)作用消失.

3.2 喹啉、吲哚共基質(zhì)下的降解均符合零級反應(yīng)動力學(xué).

3.3 共基質(zhì)時喹啉的主要代謝產(chǎn)物為2(1H)喹諾酮與8-羥基-2(1H)喹諾酮;吲哚的主要代謝產(chǎn)物為2-吲哚酮與靛紅.

3.4 喹啉、吲哚共基質(zhì)時,微生物菌門主要以: Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Acidobacteria為主菌綱以Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria為主,菌屬以、、和為主.

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Degradation of quinoline and indole co-substrate under anaerobic denitrification and methanogenesis conditions.

GAO Yan-juan, YUE Xiu-ping*, DUAN Yan-qing, ZHANG Zhi-chun, ZHANG Xiao, LUO Yan-hong

(College of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China).e, 2019,39(10)：4150~4156

Bath experimrnts were conducted to study the degradation characteristics and microbial community of quinoline and indoles co-substrate under anaerobic denitrification and methanogenesis conditions, which were known as typical N-heterocyclic compounds.The results showed that the presence of quinolone could inhibit the degradation of indole, and the inhibition effect was enhanced with the increase of quinoline concentration; the presence of indole could promote the degradation of quinoline, but the high concentration of indole (150mg/L) inhibited the degradation of quinolone; the kinetics of quinoline and indole was followed the zero-order kinetics model; through GC-MS analyses, the intermediate metabolites of quinoline were 2-hydroxyquinoline and 2,8-dihydroxyquinoline; and metabolites of indole were oxindole and isatin. The high-throughput sequencing technology was used to analyze the microbial community structure, and results indicated that the functional bacterial were enriched in the anaerobic denitrification and methanogenesis system. The bacterial phylum was Proteobacteria, the dominant classes were Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria, and the dominant genera were,,,and.

anaerobic；denitrification and methanogenesis；co-substrate；intermediate metabolites；microbial communit

X703

A

1000-6923(2019)10-4150-07

高艷娟(1988-),女,山西呂梁人,博士,主要從事水污染控制與研究方面研究.發(fā)表論文1篇.

2019-03-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(51378330)

* 責(zé)任作者, 教授, yuexiuping@tyut.edu.cn