黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠PI3K/AKT/HIF-1α通路的作用①

劉 楊 姜珊珊 陳向云 楊 欣 嚴(yán)福林 曹 峰 楊長福 梁 江

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽550025)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為自身免疫病，病理表現(xiàn)為滑膜成纖維細(xì)胞病理炎性增生、微血管生成以致骨關(guān)節(jié)面受累，后期關(guān)節(jié)畸形難愈。臨床治療藥物多針對多種靶點(diǎn)減輕關(guān)節(jié)和滑膜炎癥，抑制滑膜異常病理增殖，如甾體或非甾體抗炎藥、免疫抑制劑等。又由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者自身免疫失衡，T細(xì)胞、B細(xì)胞參與關(guān)節(jié)滑膜中TNF-α、IL-1、IL-4、IL-17等炎癥因子異常表達(dá)，可引起骨代謝異常和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，可激活PI3K/AKT信號及下游蛋白通路加重病情[1-3]。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊由青風(fēng)藤、黑骨藤、追風(fēng)傘構(gòu)成，輔料為淀粉。屬貴州同濟(jì)堂藥業(yè)獨(dú)家開發(fā)的專利新藥，針對西南地區(qū)高原風(fēng)寒濕氣候所誘發(fā)的風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者有較好的治療效果。前期研究已表明黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊內(nèi)所含成分黑骨藤有較好的抗炎作用[4-6]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，本文采用膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)制作類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型PI3K/AKT/HIF-1α信號通路的影響，闡明其潛在有效作用機(jī)制，為黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊，批號20170217，由國藥集團(tuán)老來福(貴州)藥業(yè)有限公司提供。PI3K抑制劑LY294002，貨號S1737，由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊給藥量按正常人體重為60 kg計(jì)算，大鼠給藥量按照人一天服用量的7倍進(jìn)行換算后灌胃服用。

1.1.2動物 雄性SD大鼠，180～220 g，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號為SCXK(湘)-2014-0011，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，室溫(20±2)℃。動物所用飼料也由上述單位提供。

1.1.3試劑 牛Ⅱ型膠原，批號20021，由Chond-rex公司提供。完全弗氏佐劑，批號F5881，Sigma公司提供。β-actin、Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白，貨號為ab8226、ab1872、ab13847、ab90529、ab179483、ab32503、ab196495，由Abcam公司提供。p-PI3K、p-AKT蛋白，貨號#4228和#13038，由CST公司提供。TUNEL染色試劑盒，貨號C1091，由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。山羊抗兔HRG抗體，批號為109525，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，貨號G1120，由北京索萊寶生物科技有限公司提供。IL-2、IL-4、IL-17 ELISA試劑盒，貨號為ERC001、ERC002、ERC170，由欣博盛生物科技有限公司提供。

1.1.4儀器 KD-202A石蠟切片機(jī)，由浙江科迪儀器設(shè)備有限公司提供。CX21型光學(xué)顯微鏡，由日本Olympus公司提供。開拓牌數(shù)顯百分測厚儀，由河南華方信息技術(shù)有限公司提供。Thermo Fisher Multiskan FC酶標(biāo)儀，由美國Thermo公司提供。

1.2方法

1.2.1類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型制作 準(zhǔn)備雄性SD大鼠若干只，隨機(jī)區(qū)分為空白組和造模組，根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]造模組大鼠于第0天和第7天尾根部皮下注射牛 Ⅱ 型膠原與完全弗氏佐劑混勻液誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。致炎后觀測大鼠足趾關(guān)節(jié)腫脹度，按下列標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算評分：0分為雙側(cè)各足跖趾無紅腫；1分為雙側(cè)足跖趾輕度腫脹；2分為雙側(cè)足跖趾中度腫脹；3分為雙側(cè)足跖趾重度腫脹；4分為雙側(cè)足跖趾、踝關(guān)節(jié)全部腫脹或伴有畸形。評分1分以上則隨機(jī)入組給予藥物治療。選取造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊(0.315 g/kg)組(膠囊組)、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊(0.315 g/kg)+PI3K抑制劑LY294002(0.01 g/kg)聯(lián)合給藥組(聯(lián)合給藥組)，每組8只。空白組8只，空白組灌胃服用等體積生理鹽水，其余各組用羧甲基纖維素鈉調(diào)配成相應(yīng)濃度混懸液灌胃，連續(xù)給藥5周。末次給藥后測量每組大鼠足跖部厚度后，腹主動脈取血備用，取部分脾臟放入4%多聚甲醛固定，取剩余脾臟、同側(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2足跖部腫脹度測量 采用厚度測量儀測量大鼠雙后肢足跖部炎癥誘導(dǎo)前和炎癥誘導(dǎo)后每周腫脹度(腫脹度=炎癥誘導(dǎo)后厚度-炎癥誘導(dǎo)前厚度)，記錄并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3脾臟HE染色觀察病理變化 低濃度至高濃度乙醇分別脫水，每次1.5 h；二甲苯透明2次，每次30 min；石蠟浸蠟2次，每次3 h。自動包埋機(jī)包埋后將包埋好的組織制作成切片。常規(guī)二甲苯脫蠟2次，每次20 min；高濃度到低濃度乙醇水化；蘇木素染色10 min；自來水沖洗反藍(lán)；鹽酸酒精分化5 s后伊紅染色5 min；95%乙醇、100%無水乙醇分別脫水10 min；二甲苯透明10 min；中性樹膠封片后分析結(jié)果并評分。動脈周圍淋巴鞘細(xì)胞密度評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，細(xì)胞密度無變化；1分，細(xì)胞密度輕微增多；2分，細(xì)胞密度中度增多；3分，細(xì)胞密度重度增多。初級濾泡增生評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無增生；1分，輕度增生，可見部分生發(fā)中心發(fā)育；2分，中度增生，生發(fā)中心發(fā)育明顯；3分，過度增生，生發(fā)中心增多。

1.2.4TUNEL染色觀察脾臟凋亡細(xì)胞表達(dá) 低濃度至高濃度乙醇分別脫水，每次1.5 h；二甲苯透明2次，每次30 min；石蠟浸蠟2次，每次3 h。自動包埋機(jī)包埋后將包埋好的組織制作成切片。常規(guī)二甲苯脫蠟2次，每次20 min；高濃度到低濃度乙醇水化；根據(jù)試劑盒提供方法滴加不含DNase的蛋白酶K，37℃孵育30 min；PBS沖洗3次，每次5 min；3%過氧化氫封閉30 min；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標(biāo)記液；DAB顯影，95%乙醇、100%乙醇分別脫水10 min；二甲苯透明10 min；中性樹膠封片后Image Pro-Plus6.0軟件分析平均光密度值表達(dá)。

1.2.5Western blot檢測關(guān)節(jié)和脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C；滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) BCA蛋白定量法蛋白定量后，SDS-PAGE凝膠制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h后加一抗，內(nèi)參一抗1∶8 000、其他一抗1∶1 500，TBST沖洗3次，加入二抗1∶7 000，TBST沖洗3次，顯影液顯影，拍照后Image Pro-Plus6.0軟件分析結(jié)果。

1.2.6ELISA試劑盒檢測血漿IL-2、IL-4、IL-17表達(dá) 取大鼠血漿，根據(jù)試劑盒要求，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，按試劑盒操作步驟加入樣本測量OD值。

2 結(jié)果

2.1黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠足跖部炎性腫脹度的影響 造模后，與空白組比較，模型組大鼠足跖腫脹程度明顯增大(P<0.01)。給藥后，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組和聯(lián)合給藥組大鼠足跖腫脹明顯減輕，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這表明黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組和聯(lián)合給藥組雖能減輕炎性腫脹，但效果不及空白組，見表1。

2.2黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟病理的影響 病理觀察模型組大鼠脾臟生發(fā)中心數(shù)量減少或萎縮，動脈周圍淋巴鞘數(shù)量減少，初級濾泡數(shù)量降低。與模型組比較，空白組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組、聯(lián)合給藥組動脈周圍淋巴鞘數(shù)量增加，初級濾泡數(shù)量明顯增多，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2，圖1。

Groups1 weekLeftRight2 weeksLeftRight3 weeksLeftRight4 weeksLeftRight5 weeksLeftRightControl0.221±0.1964)0.200±0.1114)0.271±0.1474)0.223±0.1354)0.313±0.1914)0.349±0.1654)0.338±0.2264)0.406±0.1464)0.459±0.2454)0.479±0.1624)Model1.725±0.5372)1.445±0.4422)2.034±0.4242)1.916±0.3812)2.871±0.2952)2.889±0.4162)3.024±0.2922)2.816±0.2752)3.118±0.3362)3.136±0.1952)Capsule1.421±0.6262)1.685±0.5422)1.760±0.2032)1.814±0.3922)2.078±0.5582)4)2.120±0.3762)4)1.944±0.2282)4)2.075±0.2242)4)1.901±0.2452)4)2.021±0.2022)4)Combined treatment1.828±0.3892)2.104±0.5542)1.811±0.3922)2.099±0.2862)1.933±0.2562)4)2.091±0.2392)4)1.995±0.2422)4)1.953±0.3612)4)1.968±0.2072)4)1.992±0.3122)4)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

GroupsCell density score of periarteriallymphoid sheathScore ofprimary follicleControl2.375±0.7444)1.250±0.7074)Model0.625±0.5182)0.375±0.5172)Capsule1.500±0.5343)1.750±0.4624)Combined treatment1.375±0.5173)1.500±0.7554)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

圖1 黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟病理變化的影響(×200)Fig.1 Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on pathological change of spleen in RA rats(×200)

2.3黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響 與模型組相比，空白組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組、聯(lián)合給藥組分別降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟凋亡細(xì)胞平均光密度值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠凋亡細(xì)胞平均光密度值明顯增加，而黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組、聯(lián)合給藥組大鼠脾臟凋亡細(xì)胞平均光密度值明顯降低。見表3，圖2。

2.4黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與模型組相比，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊可降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟內(nèi)Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表達(dá)。聯(lián)合給藥組可同樣降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。見表4，圖3。

2.5黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑

GroupsAverage optical densityControl0.121±0.1232)Model0.322±0.1861)Capsule0.128±0.1062)Combined treatment0.133±0.0912)

Note：Vs control，1)P<0.05;vs model，2)P<0.05.

膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與模型組相比，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊可顯著降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2蛋白表達(dá)，提高Bax蛋白表達(dá)(P<0.01，P<0.05)。聯(lián)合給藥組也同樣降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)。 見表5，圖4。

2.6黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血漿IL-2、IL-4、IL-17表達(dá)影響 與空白組比較，模型組IL-2和IL-17表達(dá)升高與空白組有明顯差異(P<0.01)。IL-4表達(dá)無差異。與模型組比較，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對血漿中IL-4有上調(diào)作用，對IL-2和IL-17表達(dá)有下調(diào)作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。聯(lián)合LY294002可同樣升高血漿中IL-4表達(dá)，降低IL-2和IL-17表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。見表6。

圖2 黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響(×200)Fig.2Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on apoptosis of spleen cells in RA rats(×200)

GroupsCaspase-1Caspase-3Cytochrome-CControl0.052±0.0414)0.037±0.0464)0.085±0.0613)Model0.378±0.1102)0.230±0.0982)0.162±0.0491)Capsule0.055±0.0694)0.053±0.0354)0.066±0.0454)Combined treatment0.060±0.0484)0.093±0.0763)0.039±0.0474)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

Groupsp-PI3Kp-AKTHIF-1αBaxBcl-2Control0.004±0.0054)0.085±0.0724)0.004±0.0054)0.002±0.0024)0.021±0.0203)Model0.381±0.2882)0.397±0.1452)0.174±0.1532)0.107±0.0452)0.128±0.0871)Capsule0.033±0.0494)0.102±0.1253)0.009±0.0114)0.381±0.2222)3)0.017±0.0173)Combined treatment0.031±0.0414)0.008±0.0141)4)0.007±0.0114)0.320±0.1352)4)0.034±0.0273)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

GroupsIL-2IL-4IL-17Control84.478±41.0184)65.362±38.19872.403±37.2914)Model174.183±57.1912)88.099±33.042167.354±63.3072)Capsule110.539±28.3974)151.614±48.6452)4)73.030±43.9054)Combined treatment92.262±50.0674)166.077±90.4201)3)86.469±51.8913)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

圖3 黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟中Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on expression of Caspase-1,Caspase-3,Cytoch-rome-C protein in spleen of RA rats

圖4 黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on expression of PI3K,AKT,HIF-1α,Bax,Bcl-2 protein in Synovial tissue of RA rats

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床發(fā)病率較高的自身免疫性疾病，病情復(fù)雜，并發(fā)癥嚴(yán)重，復(fù)發(fā)率較高，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷或致畸，終身難愈，多年來受到醫(yī)學(xué)界高度關(guān)注。隨著科技進(jìn)步，多種免疫抑制劑、藥物提取物在控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)作期癥狀和緩解自身免疫炎癥所致骨質(zhì)侵蝕方面，取得了明顯的療效，但這些藥物也存在較多的藥物不良反應(yīng)，引發(fā)后續(xù)多器官損害。中藥復(fù)方(包括湯劑、中成藥)基于中醫(yī)辨證論治在改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者臨床表現(xiàn)、減少并發(fā)癥和降低復(fù)發(fā)率、促進(jìn)患者其關(guān)節(jié)功能恢復(fù)，延緩自身免疫性炎癥帶來的后遺癥方面取得了良效。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊作為貴州同濟(jì)堂制藥有限公司專利藥物，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消痹止痛的功能，但具體臨床作用機(jī)制與治療靶點(diǎn)未有深入挖掘。成藥中所含黑骨藤善于通經(jīng)絡(luò)，祛風(fēng)濕，活血消炎，專治跌打損傷，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，口腔炎，乳腺炎等[8]。所含青風(fēng)藤善于祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利小便，專治風(fēng)濕痹證、關(guān)節(jié)腫脹、麻痹瘙癢、水腫、腳氣等[9]。所含追風(fēng)傘善于祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛。專治風(fēng)濕痹痛、四肢拘攣、半身不遂、小兒驚風(fēng)、跌仆、骨折等[10]。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊現(xiàn)階段已實(shí)驗(yàn)證實(shí)可通過調(diào)節(jié)免疫器官功能起到抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。同時有報(bào)道也指出黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊也存在一定的藥物毒性，這對完善黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的用藥安全認(rèn)識提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)[11]。還有報(bào)道稱黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊可通過影響miR-146a、miR-16的表達(dá)，調(diào)控關(guān)節(jié)液中炎癥因子的釋放，減輕炎性反應(yīng)和緩解骨侵蝕，從而減輕風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛，改善風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者生活質(zhì)量。而類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為自身免疫病，現(xiàn)階段共識是炎性反應(yīng)的過度激活是導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜增生和骨質(zhì)破壞的重要因素[12]。PI3K/AKT/HIF-1α信號通路是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的重要因素，PI3K蛋白家族可被多種細(xì)胞因子激活，在細(xì)胞分化、代謝、炎癥、細(xì)胞活力和誘發(fā)癌癥發(fā)揮重要作用。AKT蛋白最初作為一個胰島素細(xì)胞內(nèi)信號，是細(xì)胞生長、增殖等關(guān)鍵蛋白的受體信號，也是PI3K蛋白下游被其激活的蛋白，它的激活可引起多種蛋白的連鎖反應(yīng)，如mTORC蛋白復(fù)合體、核糖體S6激酶、凋亡蛋白前體活化、NF-κB蛋白通路、Bcl-2凋亡相關(guān)的啟動子等[13]。HIF-1α可在組織損傷情況下根據(jù)含氧量的變化形成微血管增生和營養(yǎng)供應(yīng)，它不斷地合成和降解，促使機(jī)體對缺氧壓力做出迅速反應(yīng)。在缺血缺氧、炎癥等疾患中，HIF-1α降解被抑制，并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β形成二聚體，進(jìn)而激活并引發(fā)下游多種生物信號反應(yīng)并促進(jìn)新生血管的生成，而血管翳的過度增殖在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中被認(rèn)為是有害的[14,15]。CD4+T細(xì)胞亞群Th1/Th2細(xì)胞及Th17/Treg細(xì)胞之間的失衡目前也被認(rèn)為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病直接因素之一，Th1和Th17細(xì)胞可產(chǎn)生IL-2、IL-17等造成關(guān)節(jié)滑膜炎的發(fā)生，Th2細(xì)胞分泌IL-4可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎TNF-α、IL-1、IL-6的過度釋放，發(fā)揮抗炎作用。Bcl-2家族是參與細(xì)胞凋亡的核心家族，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2為抑制凋亡蛋白，二者動態(tài)變化可引起線粒體膜通透性改變，激活線粒體凋亡通路[16，17]Caspase家族是一種促使細(xì)胞凋亡的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中被多種凋亡信號調(diào)控。Caspase-1可以激活I(lǐng)L-1前體，激活炎癥。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，也是線粒體凋亡通路和死亡受體通路的交匯點(diǎn)。在損傷、炎癥等各種促凋亡信號的激活下，線粒體釋放Cytochrome-C，使Caspase家族酶原之間因相互靠近并自我剪切而活化，激活Caspase-3，從而啟動Caspase級連反應(yīng)。通過對膠原誘導(dǎo)構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型分析后表明，模型組大鼠足跖部腫脹度明顯增加，而黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊可抑制大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2蛋白過表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)量，增加滑膜細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而減輕足跖腫脹程度(P<0.01)，與PI3K抑制劑LY294002聯(lián)用給藥后表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，起到抑制炎癥發(fā)展的作用(P<0.01)。模型組大鼠免疫器官脾臟內(nèi)凋亡細(xì)胞表達(dá)明顯增加，Caspase-1，3、Cytochrome-C蛋白表達(dá)顯著增加，而黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊和聯(lián)合給藥組均抑制其過度增殖(P<0.01，P<0.05)，減輕脾臟內(nèi)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。與空白組比較，模型組大鼠IL-2表達(dá)增加，IL-4表達(dá)無顯著變化，IL-17表達(dá)增強(qiáng)。與模型組比較，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組和聯(lián)合給藥組能明顯下調(diào)IL-2、IL-17的表達(dá)，上調(diào)IL-4的表達(dá)，對Th1/Th2細(xì)胞及Th17/Treg細(xì)胞之間有潛在的調(diào)節(jié)作用。綜上，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊可影響PI3K/AKT/HIF-1α信號通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎內(nèi)表達(dá)，從而引起一系列調(diào)節(jié)作用。